R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) ve P30EY014104: Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numaraları altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü tarafından desteklendi. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Ek destek Massachusetts Lions Göz Araştırma Fonu (KMC) ve (KMC için) önleyin Körlük için Research Özel Scholar Ödülü tarafından sağlanmıştır.

Hayvanlar üzerinde deneyler tüm Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği uyarınca ele alındı ​​ve kurallar ve yönetmelikler Massachusetts Eye and Ear Revir Hayvan Bakım Komitesi tarafından belirlenen. deneyden önce gün: Akış Odası için Boru 1. Hazırlık <ol><li> Boyun yan hazırlamak için, 5 cm polietilen boru ardından 6 cm silikon tüp 1 cm PI10 polietilen boru bağlayın. Karotid tarafı için, yaklaşık 1.5 cm uzakta 1 cm polietilen boru ile 6 cm arasında, silikon boru içinde, bir T-boru ilavesi ile boyun tarafına Benzer hazırlanması (Şekil 1A, B). T-tüp yerleştirmek için, gerekirse ince forseps kullanarak silikon tüp genişletmek. </li><li> Basınç dönüştürücü silikon tüp 10 cm bir ucunu sonra karotis s T ucunudiğer ucunu ide T-tüp. Siteler sıkı bağlantı sağlamak ve ücretsiz kaçak. Gerekirse boru, birlikte neresinde üzerinde parafilm küçük bir dikdörtgen parça uygulayın, kaçak (Şekil 1C) önlemek için. </li></ol> 2. Odası Kaplama <ol><li> Endotel yüzey kaplama proteini hazırlanması (yani, P selektin, hücreler arası yapışma molekülü-1 (ICAM-1), vasküler hücre yapışma proteini-1 (VCAM-1)),% 0.1 BSA içinde. Yol gösterici olarak, protein 1 mg, 200 ul BSA 4-5 odalar kaplamak için yeterlidir. Endotel yüzey kaplama proteini ile her bir bölme (0.04 x 0.4 x 50 mm) enjekte bir 25 G iğne bağlı 1 ml&#39;lik şırınga kullanarak. Gece boyunca 4 ° C de, 15 ml bir tüp içinde kaplanmış bölmeleri saklayın. </li></ol> Deney günü: 3. Odası Hazırlama <ol><li> 4 ° C kaplı odaları çıkarın ve her tarafa boyun ve karotid boru bağlayın. Bağlant Sealdikkatle boru odasını buluştuğu üzerinde parafilm küçük bir dikdörtgen parça gererek ons. Bir şırınga kullanarak,% 0.1 BSA (sızıntı olup olmadığını kontrol edin) ile odasını ve tüp doldurun. 45 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Çanak her iki tarafındaki çentik açılarak bölmeyi tutmak için bir 35 mm Petri kabı hazırlanır. Çentikler odacığı stabilize; Daha sonra çentikli yerinde çanak odasına tutturmak için silikon küçük bir damla kullanın. Kamara mikroskop altında bakarak düzeyi olduğundan emin olun. Silikon en az 15 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Heparin ile 60 ml&#39;lik kilitleme şırınga doldurun ve basınç dönüştürücü bağlanın. Transducer, silikon tüp, ve T-tüp: karotid aşağıdaki sırayla boruya basınç sensörü bağlayın. <ol><li> Dönüştürücü ve bağlantıyı sabitlemek T-tüp bağlı silikon tüp arasında 1 cm PE50 kullanın. Basınçlı bilezikte (Şekil 1D) ile karotid arter silikon boru geçirin. 100USP heparin uçtan bir uca koşöf hava kabarcığı boru ve bölme vardır kadar. </li></ol></li></ol> 4. Yazılım kurma <ol><li> Yazılımı hazırlamak için, bilgisayar, mikroskop, ve açık laboratuar aygıtı açın. Çift Leica uygulama paketi (LAS) (veya eşdeğeri) üzerine tıklayın ve video kaydetmek için bir klasör hazırlamak: göz → edinmekte → Film → kliplerinin dizisi tanımlamak (klipleri = 15, kayıt süresi = 30 sn ve aralıkları = 15 sn) sonra onaylamak için &quot;+&quot; işaretine tıklayın. </li><li> Akış basıncı yukarıda adım 4.1 kayıt klasörüne dosya adını LabChart (veya eşdeğeri) dosyasını açmak ve koordinat kaydetmek için. </li></ol> 5. Cerrahi Prosedür <ol><li> Ketamin (60 mg / kg) ve ksilazin (6 mg / kg) bir kombinasyonu kullanılarak 8-10 haftalık fare anestezisi intraperitoneal (İP) enjekte edildi. Derin sedasyon pedalı geri çekme refleksi kaybı ile 5-10 dakika içinde ulaşılır doğrulayın. Gerekli izofluran isegerektiği gibi yüz maskesi yoluyla teslim verilebilir. </li><li> Anestezi altında iken, kafesin altındaki bir ısıtma pedi yerleştirmek ve vücut ısısını korumak için 37 ° C olarak ayarlanır. Uygun anestezi onaylandıktan sonra, göz kuruluğu önlemek için bacitracin merhem ile ventral pozisyonda ve kat gözleri fare koyun. </li><li> Bundan sonra, bir jilet kullanarak insizyon yerinde saç tıraş ve iyice alkol ile siteyi temizleyin. </li><li> Tam anestezi kez bant ventral pozisyonda fareyi tutarak hayvan sabitleyin. Makasla boyun alanı Açığa ve trakea ve gemiler (Şekil 2A) maruz tiroid bezi çıkarın. </li><li> Tam vagus siniri (Şekil 2B) zarar vermemeye dikkat ederek ortaya çıkıncaya kadar karotid arteri temizleyin. Sütür bir parça katlayın ve sonra karotis altında sütür 2 adet şimdi yani viraj kesilmiş karotid arter altında viraj geçmek. Döngü knot içine her sütür (sıkmayınknot). </li><li> Aynı şekilde (Şekil 2B) sütür hazırlamak, sol juguler ven (Şekil 2C) maruz aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Fare damar boru bağlayın. <ol><li> Heparin IP 1 ml enjekte edilerek fare Heparinize. </li><li> Karotis arter üst dikiş sıkın. Karotis arter (Şekil 3A) gitmek ahlaka damar kelepçesini yerleştirin. Microscissors (Şekil 3B) kullanarak, küçük bir kesi, arter çevresi yaklaşık 1/8 üst dikişle arteri tutun ve yapmak için forseps kullanın. </li><li> Üst dikiş ve arterde yapılan kesi içine ikinci düğüm ile karotis arter boru geçirin. Arter (Şekil 3C birkaç knot sıkı bir mühür sağlamak için yapılmalıdır) boru etrafına sızdırmaz şekilde alt dikiş kapalı kravat. </li><li> (Şah damarı tüp sokulması için gemi aynı işlemi tekrarlayınKelepçe boyun tarafı için gerekli değildir, Şekil 3B). </li><li> Damar kelepçesini bırakarak akışını sınayın. Hiçbir sızıntı yoksa mikroskop fareyi ve oda tüp (cerrahi işlemin gösteri için ekli video) karotis boru ve şah damarını bağlamak. </li></ol></li></ol> 6. Kayıt Rolling Hız <ol><li> Fare dolaşım sistemi ile bir devre yaparak, odasını doldurmak için karotis kelepçesini açın. Akış koşulları stabilize böylece kan 3-5 dakika dolaşmaya izin verin. Odacık mikroskop amacı ile bir ucundan diğerine düzeyi ve kenar ekranındaki video kayıt penceresi ile paralel olacak şekilde 3-5 dakika bekliyor döneminde, mikroskop sahne ayarlayın. </li><li> Odasından akan hücreler görülebilir böylece daha sonra yemeğin içine 10X suya daldırma hedefi düşük su ile cam haznesi içeren modifiye Petri kabı doldurun.ışık yoğunluğu hücrelerinin yeterli görüntüleme için ayarlanması gerekebilir. Genel olarak daha düşük bir yoğunluk daha iyidir. </li><li> Transdüser orta fizyolojik akış basıncı ilişkilendirerek, sürekli bir 30 mm Hg okur ya da arzu edilen boru kelepçeyi ayarlayın. </li><li> Basın video ve juguler ucuna yakın ve tamamlanana kadar karotis sonuna doğru akışına karşı hareket ilk kez sukut ile basınç hem de kayıt başlatmak için &quot;start&quot;. Not: Farklı yapışma molekülleri ile çeşitli kaplama koşullarının çok bölme ile aynı fare incelenebilir. Sadece bir bölme, bir zaman kaydedilmektedir. <ol><li> Kayıt tamamlandığında, kan akışını durdurarak, giriş yerinde vanasını kapatın. Odasına çıkarın ve diğer yandan bir yandan ince forseps ve yivli forseps kullanarak devre (farklı yapışma molekülü ile kaplı) yeni bir odasını uygun. Adımlarda belirtildiği gibi yeni odası için kayıt Özgeçmiş6,1-6,4. </li></ol></li><li> CO deney sonunda bir omurilik dislokasyon 2 boğulmaya tüm fareler öldürülür. Böylece işlem fareler deney sonunda bir omurilik çıkık terminal ötenazi edilir. </li></ol> 7. Sonuçları yorumlama <ol><li> Kaydedilen veriler ImageJ yazılım 23 &quot;M TrackJ&quot; eklenti kullanmak analiz etmek. </li><li> Dosya seç → ithalat → AVI → gri tonlama dönüştürmek tarafından gri tonlama dosyayı dönüştürün. </li><li> Küresel → çerçeve aralıkları (i) girin mülkiyet → → → seçeneğini görüntü ile kareleri standart hale. (Resim J video penceresinin üst köşesinde gösterilir) bir video kare sayısına göre toplam video süresi (genellikle 30 sn) bölünmesiyle çerçeve aralıklarını hesaplayın. </li><li> M TrackJ → bir lökosit seçin parçaları ekleyin → → Seç eklenti tarafından her lökosit akışını ölçmek→ 15 her çerçeve ile Takip - 20 sn → Merge. </li><li> Görünümünde tüm lökositler için yineleyin 7.4. </li><li> İki sütun Kopyala → M TrakJ tüm görünür → Seç tedbir lökositlerin ortalama haddeleme hızı belirleyin: Bir elektronik tabloya izler. &quot;V demek&quot; etiketli sütun piksel / saniye olarak ölçülen lökosit haddeleme olduğunu. 2/3 bölerek mikron / sn dönüştürmek. </li><li> Bir elektronik tabloya basınç veri vurgulamak ve ihracat analiz ve aşağıdaki hesaplamayı gerçekleştirmek için: Ap (mm Hg) ve t (din / cm 2) Her bir deney grubu arasında bir karşılaştırma için. Hesaplanan kez, grafik için prizma yazılımına veri kopyalama. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

lökosit işe süreci inflamatuvar yanıt çok önemli bir adımdır; Bu onların efektör işlevini yerine getirmesini mümkün hedef dokulara doğru dolaşım sistemi için lökositlerin migrasyonunu içerir. Lökositin görevlendirilmesi, aterosklerotik istilanın, miyokardiyal enfarktüs, iskemi / reperfüzyon ve transplant ameliyatını 1, hem de birden çok merkezi sinir sistemi ile ilgili nöro-enflamatuar durumların 10-12,20,24,25 gibi inflamatuar olaylardaki çeşitli ayrılmaz bir parçasıdır. Lökosit işe açıklıklı, autoperfused Mikrosirkülasyon odası araştırmacı lökosit göç dinamiklerini incelemek için yeteneği sağlayan vazgeçilmez bir aracı sağlar hastalık koşulları çeşitliliğini göz önüne alındığında. Son birkaç on yıl boyunca, in vitro tahlillerin çeşitli lökosit hücre yapışmasının 26 dinamikleri üzerinde çalışmak üzere geliştirilmiştir. Ne yazık ki, bu tahlillerin tümüne çıkarılmasını gerektirirkandan lökositler, mekanik aktivasyon tanıtan. In vivo ortamda yakın olsun, uyarlamalar tam kan örnekleri toplamak ve hemodinamik akış koşulları 16,17 kontrol yapılmıştır. Burada, biz fare dolaşım sistemine kaplanmış odayı bağlayarak alanında önceki avans. Biz bir fizyolojik aralık kan akışını düzenleyen ve lökosit haddeleme dinamiklerini incelemek mümkün. kaplanmış odası bize belirli yapışma molekülleri ile lökosit etkileşimleri çalışmak için yeteneği verir. Sistem, canlı fare tarafından işletilen bir birim olarak görev olduğu için, daha yakından bize immünolojik fare modellerinde çeşitli lökosit-endoteliyal etkileşimler üzerinde çalışmak için izin doğal çevreye taklit eder. Ayrıca, bu sistem bize mevcut çoklu genetik fare modellerinin yararlanmak için izin verir. Sistem tamamen in vivo ortamda çoğaltma değil iken, specifi incelemek için bir platform sağlarfizyolojik koşullar altında lökositlerin c elemanları, daha önce mümkün olmayan bir başarı. Bu bir adım daha yakın, daha fizyolojik bir ortamda bizi alır olsa sisteme sınırlamalar vardır. Biz odası kaplama sınırlıdır lökosit etkileşimlerinin bazı unsurları değerlendirmek için sadece edebiliyoruz, böylece tamamen damar karmaşık 3D matrisi çoğaltma değil. Buna ek olarak, büyük bir dikkatle protokolde belirtilen tüm adımları fare dolaşımı için bir kapalı sistem sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Hava kabarcıklarının giriş ölçüde deney doğruluğunu ve tekrarlanabilirlik etkileyecektir. Biz lökosit haddeleme dinamikleri değerlendirmek için Autoperfused Microflow odanın kullanımını tarif ederken prosedür çeşitli hastalıkları çalışma araştırmacılar tarafından kişiselleştirilmiş bir potansiyele sahiptir. Örneğin, kanser hücreleri, lökositler tarafından paylaşılan ortak integrinler çok ifade metastaza. Studying daha yakından bilgi yardımcı olabilecek bir in vivo ortamı taklit eden bir ortamda, ve bazı kanser hücrelerinin invaziv doğası muhtemelen tahmin, onların haddeleme dinamiği. Olası metotlardan biri, GFP ifade eden kanser hücrelerinin haddeleme dinamikleri parça akış odası deneyi ile birlikte böyle bir GFP 27 kanser hücreleri için bir etiketleme tekniği birleştirmek olabilir. Bu prosedür, genetiği değiştirilmiş fareler ve hastalık modelleri ile birlikte diğer laboratuarlarda kullanılmak üzere modifiye nasıl görmek ilginç olacak maddelerin çeşitli odasına kaplanması ve aynı fare birden odaları bağlayan esnekliği göz önüne alındığında. Biz burada açıklamak tekniği sadece sadece araştırmacı yaratıcılığı ile sınırlıdır çok daha geniş bir uygulama potansiyeline dokunur.

Enflamasyon yaralanma vücudun evrensel bir yanıttır ve hem doğal ve adaptif bağışıklık sistemi fonksiyonu çok önemli bir adımdır. Yaralanma ve / veya iltihap uyarıcıya tepki olarak endotelial hücreler, belirli bir yapışma moleküllerini arttırdığı; Bu öncelikle sonrası kılcal venüllerdeki, mikrovasküler endotel ile ekstravazasyon lökosit yol açar. Bu süreç endotel üzerindeki kan dolaşımında serbest akan lökositlerin tethering ile başlar. Kararlı haddeleme ve sırayla tenasühe ve sitotoksik ajanların salgılanmasına yol açar lökositlerin, firma yapışma, bu 1,2 tethering izleyin. Selektinler kademeli 3-5 erken aşamaları neden olduğu bilinmektedir; integrinlerinin firması yapışması ve göçü 1,6-8 sonraki adımlar için sorumludur. Kanıt artan vücut iskemi reperfüzyon hasarı hayvan modellerinde lökosit ve endotel adezyon molekülleri sahip hayati rolleri önerir, Astım, psöryazi, multipl skleroz, ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon 9-12. Bu koşullar altında, inflamatuvar yanıt sağlıklı doku yıkımında ortaya çıkan, kişinin kendi bedenini saldırmaya yanlış yönlendirilmiş olduğunu. (Örneğin, non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar, kortikosteroidler ya da diğer kemoterapötik maddeler olarak) mevcut anti-enflamatuar maddeler, uzun süreli kullanım 13 ile ciddi yan etki riskini taşırlar. Bu nedenle, bu toksik olmayan 14 kalarak sonuçta istenen anti-inflamatuar etkiye sahip hedeflenebilir hastalığa özgü molekülleri tespit yeteneği, uygun araçlara sahip büyük ilgi olduğunu. Statik lökosit yapışma deneyi olarak in vitro yöntemler mevcut erken 1976 15 olarak kullanıldı. Paralel akış bölmesi, birinci akış şartları altında, lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için 1987, in vitro olarak kullanılmıştır. Bu deneylerde, Huma uyarılmışn, toplardamar kanından polimorfonükleer lökositler (PMNler), primer insan göbek damar endotelial hücrelerinde (HUVECler) bir tek tabaka içinde perfüze edildi. Hemodinamik akış koşulları kontrol etmek için, Harvard Apparatus şırınga pompası 16 kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, yapay lökosit izolasyonu önlemek için, tam kan, immobilize edilmiş yapışma moleküllerinin 17 ile kaplanmış cam bölme ile bir arada kullanılmıştır. Lökosit stimülasyonu önlemek ve mekanistik yaklaşık fizyolojik koşullar altında yapışma molekülleri ile etkileşimi incelemek için, bir ex vivo autoperfused, ekstrakorporel, arteriyovenöz devre 16 geliştirilmiştir. Bu devrede, kan tek ya da birlikte immobilize yapışma molekülleri ile kaplanmış bir cam Mikrosirkülasyon bölme içinde doğal BBL&#39;lerin etkileşimi sağlayan, anestezi altında canlı bir farenin sağ ortak karotid arter ve sol dış boyun toplardamarı arasına akar. Bu Sistemli için önemli bir avantajm, enflamatuar yollar doğrudan ya da dolaylı olarak manipüle edildiği genetik olarak fareler kullanmak yeteneğidir. Ayrıca, akış koşulları altında, dış aktivasyon serbest inflamasyon lökosit adezyon molekülleri, izole katkı saptamak için yeteneği var. Akış odasının giriş noktasında bir akış regülatörü uygulama arteriyel veya venöz sistemleri 18-22 ya taklit etmek kesme kuvvetlerinin deneysel varyasyonları geniş bir yelpazede sunmaktadır. Burada detaylı olarak ex vivo autoperfused Mikrosirkülasyon odası testinin hazırlanması ve performansı ile ilgili bir protokol açıklar.

<table><tbody><tr><td>Micro glass chamber 0.4 x 0.04 x 50 mm</td><td>VitroCom</td><td>2540-050</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing PE 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing PE 60</td><td>Fisher Scientific</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing 002</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15A</td><td></td></tr><tr><td>Y tube</td><td>Value Plastics</td><td>Y210-6</td><td></td></tr><tr><td>T tube</td><td>value plastics</td><td>T410-6</td><td></td></tr><tr><td>Silicone gel</td><td>Hardware store - Home Depo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>FST</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Tube holder</td><td>FST</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Clamp applicator</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Vascular clamp</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>6-0 silk sutures</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-1215-6/0</td><td></td></tr><tr><td>25 x 1 G needles</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>30 x 1/2 G needles</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 100 USP units/ml</td><td>Hospital pharmacy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Lökosit-Endotelyal etkileşimler, akut ve kronik iltihap erken ve kritik olaylar ve bozulmuş zaman, daimi patolojik hasarına yol açan doku hasarı aracılık edebilir. Mevcut konvansiyonel testler sadece kan lökosit çıkarma sonra lökosit adezyon moleküllerinin analiz izin. Bu periferik kan lökosit (PBL&#39;ler) da araştırma bulgularını etkileyen PBLs teşvik, hangi analiz için hazır olabilir önce birkaç adım geçmesi kan gerektirir. autoperfused mikro akış odası deneyi, ancak, bilim adamları bir kaplanmış odasını manipüle özgürlüğü yerken canlı fare sistemik akışını kullanarak fonksiyonel düzensizliği erken lökosit çalışma sağlar. Bir hastalık modeli sayesinde, lökosit adezyon moleküllerinin fonksiyonel ifadesi değerlendirilebilir ve immobilize endotel adezyon molekülleri ex vivo ile kaplanmış bir mikro-cam odasında sayısal. Bu modelde, kan akarodasında yerli BBL&#39;lerin etkileşimini sağlayan sağ karotis arter ve anestezi altında canlı farenin sol eksternal juguler ven arasında. Gerçek zamanlı deneysel analiz intravital mikroskop yardımı olarak bir Harvard Apparatus basınç aracı ile birlikte sağlanır. Cam odasının giriş noktasında bir akış regülatörü uygulama deneyleri arasında karşılaştırılabilir fizyolojik akış koşulları izin verir. Lökosit haddeleme hızı, ana sonuçtur ve Sağlık açık erişim yazılımı ImageJ Ulusal Enstitüleri ile ölçülür. Özetle, autoperfused mikro akış odası tahlil Lökositler endotel etkileşimi incelemek için optimal fizyolojik bir ortam sağlar ve inflamasyonu okuyan zaman araştırmacılar doğru sonuçlara varmak için izin verir.

<html> Her kayıt, sadece etkileşim lökositler sırasında odasının üzerine belirgindir. Temsili bir deneyden elde edilen sonuçlar, Şekil 4&#39;te görülebilir. Beyaz oklar ilgi yapışma molekülü tarafından yakalanan ve kan akışı içerisinde diğer akıcı olanlar arasında bölme boyunca yuvarlanan bireysel lökositlerin işaret etmektedir. Odasının dışında ortak bir eserdir tüm görüntüleri büyük karanlık alanlarda görülebilir. Karanlık küre okuyucu sabit bir noktaya göre lökosit hareketini takdir yardımcı. 22 saniyelik bir süre boyunca lökositler ilerleme küreler ile ilgili olarak görülebilir. Aynı şekilde grafik Tx1 haddeleme hızı (solda bir vardiya) azalır ve Tx2 kontrole göre hızı (sağa kaydırma) artar verilerin son grafiğini göstermektedir. 0 &quot;/&gt; Şekil 1: akış bölmesi için boru hazırlanması. (A) Araçlar silikon 002, Y tüpü, T tüp, 35 mm Petri, ince forseps, ince makas tüp, boru ve hazne montajı (mikro cam haznesi 0,4 x 0.04 x 50 mm, polietilen boru PI10, polietilen boru PE60 için gerekli, tüp tutucu, vasküler kelepçe, 7-0 ipek dikiş. kaplı bölmesi boyunca fare kan akışını yeniden yönlendirmek için karotis arteri ve jugular damar boru (B) hazırlanışı. (C) basınç transdüktörüne karotid arter boru bağlama. (D) kan akış hızını ayarlamak için kelepçenin içinden transdüktörden boru geçirin. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Şekil 2:.. karotid arter ve juguler ven maruz (A) dikkatlice sarı noktalı ((B) trakea maruz boyun alanını kesip dikiş bir parça geminin altında geçti böylece sağ karotis arter temizleyin hat) karotis arter özetliyor. sütür bir parça (noktalı sarı hat juguler ven özetliyor) geminin altında geçti böylece (C) sol juguler ven temizleyin. (D) gevşek üst ve alt bölgelerinde dikişlerle bağlı Yerleştir karotis arter ve juguler ven (oklar gemilerin üst ve alt bölgeleri belirtilen) olarak. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Şekil 3: tüp bağlanması tO arter ve juguler ven karotid. (A) karotis üst düğüm sıkın ve alt düğüm altında kelepçeyi yerleştirin. (B) Microscissors kullanarak, karotis küçük bir kesi yapmak, yaklaşık 1/8 çevresi (noktalı sarı daire kesi gösterir). ( C) karotis içine tüp yerleştirin ve en az iki sütür (yeşil noktalı çizgi boru ve sarı noktalı çizgi karotis arter gösterir) ile sabitleyin. (D) Benzer yeşil noktalı çizgi boru ve gösterir (juguler hortumu takın sarı noktalı çizgi juguler ven). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Şekil 4: akış cham aracılığıyla haddeleme lökositlerin Temsilcisi zaman dersber (Ölçek çubuğu = 100 mikron) (beyaz ok başları haddeleme lökositler işaret). Grafik bir grafik programına ihraç sonrası temsili sonuçlar göstermektedir (Tx1 ve Tx2 deneysel tedavi grupları ve TO kontrol grubu). Tx2 hız haddeleme lökositlerde artış yansıtan doğru kaymasına neden olurken Tx1 hızı ve tedavi edilmeyen gruba (TO) kıyasla grafik bir sol kaymasını haddeleme lökositlerin bir azalmaya yol açan yavaş lökositleri olan bir işlemi göstermektedir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.6K Görüntüleme.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar. 

Video: Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Biyomühendislik

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Gelişim Biyolojisi

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

Source: Herr, N. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53077">Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

Bir Enflamasyon Fare Modelinde Kan Hücresi-Endotel Etkileşimlerini Analiz Etmek için İntravital Mikroskopi

Source: Herr, N. et al., Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice. J. Vis. Exp. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünopatoloji

Konak-Patojen Etkileşim Modelleri

An In Vitro Flow Investigation of the Effect of Stromal Cells on Leukocyte Recruitment

Source: Munir, H. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52480">Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
The video demonstrates a method for investigating the impact of stromal cells on leukocyte recruitment. In a parallel plate flow chamber model, pro-inflammatory cytokines induce the expression of adhesion receptors by endothelial cells, facilitating neutrophil recruitment and migration. The cross-talk between stromal cells and endothelial cells diminishes neutrophil recruitment to the endothelial cells.

Stromal Hücrelerin Lökosit Alımı Üzerindeki Etkisinin İn Vitro Flow Araştırması

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation and Culture of Primary ...

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler