Işin çoğunluğu ve ilgili personel NIH hibe NS060677 ve kısmen NIH MH099559 ve (BSK kadar) MH104069 verir tarafından desteklenmiştir. Eserin de CHDI Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri göre ve UCLA Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1.1) Mikropipet, AAV2 / 5 Virüs Yükleme hazırlayın <ol><li> Virüsün enjeksiyon için iyi borosilikat cam mikropipetler kullanın. Dikey bir çekici ile iki aşamalı bir çekme programı kullanılarak mikropipet çekin. Konik bir pipet öğütücü kullanılarak 40 ° &#39;lik bir açı ile pipet. 40 um ve 6 bir şaft uzunluğu - - 7 mm kullanım için ideal olan pipet 20 bir uç çapına sahip olacaktır. Pipet ve cerrahi aletler otoklav. Tatbikatta,% 70 etanol ile silinerek sterilize edilir. </li><li> 10 ul alikolar içinde -80 ° C virüsü AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 x 10 ila 13 GC / ml) depolayın. Cerrahi öncesinde, dondurucu üzerinden hacimde çıkar ve th doldurmak için kullanılan kadar buz üzerinde saklayıne mikropipet. </li><li> Virüs, bir şırınga pompası kullanılarak mikropipet doldurun. Sıkıca takviye edilmiş bir pistonu olan bir cam şırıngaya, uygun uygun büyüklükte bir hortum sıkıştırma yoluyla hortumun bir parçasının bir ucunu. Montaj için uygun boyutta bir çıkarılabilir bir iğne sıkıştırma yoluyla boru parçasının diğer ucuna otoklavlanmış mikropipet takın. </li><li> Viral vektör yüklemeden önce, bir iğne ile 1 ml şırınga içinde Sudan Kırmızı IV (~ 1 mg / 50 mi) ile boyanmış, mineral yağ ile sistemin (27 g doldurarak boru, şırınga ve mikropipet de dahil olmak üzere pompa sisteminin hava kabarcıklarını çıkarmak ). </li><li> Cam mikropipet altında parafilm temiz bir parça yerleştirin ve 5 dağıtmak - parafilm üzerine viral vektörün 10 ul. </li><li> Geri 0.5 ml / dk&#39;da, enjektörün pistonu hareket ettirerek viral vektör Suck ve cam pipet ile ilgili vektör ve yağ arasındaki sınırı. </li></ol> 1.2) Anestezi, Saç Kesme, HKraniotomi için ead Tespit ve Hazırlık <ol><li> N2 O ve O 2, ve% 5 izofluran ile dolu odacık içine bir fare (P49-63, C57BL / 6) koyun. Maksatlı hareket kaybı ve yavaşlatılmış solunum hızı (- 90 / dk ~ 60) tarafından anestezi derinliğini değerlendirin. Fare anestezi sırasında kafasına saçlarını kesti. </li><li> Başını bir anestezi ve havalandırma sisteminin içine yerleştirilen künt kulak çubukları ve burun tarafından güvenli ile, stereotaktik çerçeve içinde fareyi takın. % 3 - 2 sürekli izofluran koruyun. Fareler anestezi altında göz kırpma refleksi kaybetmek beri her iki göze yapay gözyaşı merhem sürün. </li><li> Ağrı tedavisi için bir deri altından enjeksiyon ile Buprenorfin (0.1 mg / ml), 0.05 ml uygulayın. </li><li> % 10 povidon iyot ve% 70 alkol ile üç kez temiz bir cerrahi alan, iki çözümleri arasında değişen ve povidon iyot ile başlayan. Önden başlar ve herhangi bir önceden kesilmiş tüyleri çıkarmak için arkaya doğru silin. </li><li> Üst o bir cilt kesi yapmakgözler arasında başlar ve kulakları arasındaki biter kafa f. </li></ol> 1.3) Kraniyotomi ve Microinjections <ol><li> Bir pamuklu çubukla kaydırarak periost çıkarın ve sonra diş pamuk topları ile kafatası yüzeyini kurulayın. Enjeksiyon yeri çevresinde bir işareti yapmak, ve bir yüksek devirli tarafından desteklenmektedir küçük bir çelik çapak kullanarak işaretinin kenarına etrafında matkap. </li><li> Kemik çıkarın ve tuzlu su ile yüzeyi temizleyin. </li><li> Ön-arka 0,8, medial-lateral: şu koordinatlara (mm) striatumdaki yanal sol dorsal içine pipet yerleştirin 2,0, dorsal-ventral pial yüzeyinden: -2,4 13. Bu koordinatlar mikroenjeksiyon iğne ucu sadece biraz bu çekirdeğin içinde nüfuz anlamı sadece dorsolateral striatum (Şekil 1A, B) Yukarıda oturur anlamına unutmayın. Zararlı kan damarları kaçının. Pipet bir kan damarına doğru olması için olursa, hafifçe ayarlayın0.2 mm - 0.1 ile koordine eder. </li><li> 0.2 ml / dk&#39;da ayarlanmış enjeksiyon oranı ile enjeksiyon başlayın ve tipik olarak virüs 1-1,5 ul enjekte edilir. </li><li> 10 dakika boyunca, enjeksiyondan sonra yerinde pipet bırakın ve daha sonra yavaş yavaş pipet çıkarın. </li><li> Sürekli dikiş dış naylon sütür ile cerrahi yara kapatarak bitirin. </li></ol> 1.4) Kurtarma <ol><li> 24 saat için bir ısıtma pedi üzerine temiz bir kafes içinde fare koyun. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyatı geçirmiş fare iade etmeyin. Bu sternal yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar fare gözetimsiz bırakmayın. </li><li> Trimetoprim Sulfamethoxiazole ekleme, bir hafta boyunca su içinde (40 mg trimetoprim 200 mg sulfamethoxiazole ihtiva eden 500 ml su başına 5 mi). Ameliyat sonrası Buprenorfin kadar 3 gün boyunca günde iki kez uygulayın. </li><li> , A beslenen bir 12 saat ışık-karanlık döngüsü üzerinde fareyi korumak ve günlük sulanannd ameliyattan sonra 3 gün sonra günde başına düşen ağırlıklı. Bu 3 gün içinde,% 10&#39;dan daha fazla bir vücut ağırlığı kaybı ile herhangi bir fare tehlikeye, ve bunun yerine bir deneye tabi kalma ötenazi olacaktır olarak kabul edilir. </li><li> Ayrı, haftada iki kez fare kafes değiştirmek ve en az günde bir kez genel sağlık izlemek. Stereotaksik mikroenjeksiyon sonrası 3 hafta - Tipik olarak, fare 2 içinde kullanılır. </li></ol> Konfokal Ca 2+ Görüntüleme 2. Akut Beyin Dilim Hazırlık Kesme ve Kayıt Çözümleri 2.1) hazırlanması. <ol><li> (MM) ihtiva eden çözelti, kesme hazırlayın: 194 sukroz, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-glikoz, 1 MgCl2, 1.2 NaH 2 PO 4 ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile doymuş 26 NaHCO 3. </li><li> Içeren kayıt solüsyonu (mM olarak) hazırlayın: 124 NaCl, 4.5 KCl, 1 MgCl2, 10 D-glikoz, 2 CaCl2, 1.2 NaH 2 PO 4 </sub&gt; ve 26 NaHCO 3; pH 7,3-7,4, 290 -% 95 O2 ve% 5 CO2 ile doymuş 295 mOsm. Kayıt çözümü ile beyin dilim tutarak beher doldurun ve 34 ° C&#39;de tutmak. </li></ol> 2.2) Dilimleme <ol><li> İki üç hafta stereotaksik mikroenjeksiyon sonra, derin ve ölümcül fare uyutmak, ve sonra başını kesmek. </li><li> Beyin ayıklayın ve uninjected sağ yarımkürede kaldırmak için bir bıçak kullanın ve süper yapıştırıcı kullanarak Vibratome tepsiye bıraktı birini monte edin. Buz gibi soğuk kesim tamponu ile Vibratome tepsiyi doldurun, ve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile doyurarak tutun. </li><li> 300 mikron kalınlığında koronal veya sagittal striyatal beyin dilimleri kesin. Genellikle, 4-5 koronal veya 6-7 sagital striyatal dilim alınabilir. </li><li> 34 ° C&#39;de ısıtıldı dilim tutarak behere dilimleri transferi ve daha sonra recordi oda sıcaklığında depolamadan önce, 30 dakika boyunca orada tutmakng. </li><li> [Ca2 +] görüntüleme önce en az 30 dakika oda sıcaklığında oksijenli bir kayıt tamponu içinde beyin dilimleri inkübe edin. </li></ol> 3. İmmünohistokimya (İHK) <ol><li> İki hafta virüsünün, enjeksiyondan sonra, transkardiyal PBS ile fare PBS içinde% 10 formalin ve ardından serpmek. </li><li> Kaldır gecede sonrası düzeltmek ve en az 2 gün tamponlu% 30 sakaroz beyin cryoprotect. </li><li> Bir kriyostat mikrotom kullanılarak 40 um bölümler hazırlayın. </li><li> 10 dakika aralıkla kesitler, PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> % 10 normal keçi serumu ile PBS içinde 1 saat süre ile ve% 0.5 Triton X-100 ile bölümleri inkübe edin. </li><li> % 0.5 Triton X-100 içeren PBS içinde hazırlanan primer antikor içinde 4 ° C&#39;de bir gece boyunca bölümleri inkübe edin. Bu kapsamda kullanılan primer antikorlar: tavuk anti-GFP, 1: 1000 fare anti-S100β 1: 400, fare anti-neun 1: 600, fare anti-glutamin sentetaz 1: 300 arasındadır. </li><li> 10 m bölümlerinin PBS ile 3 kez durulayınaralıklarla. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca,% 10 normal keçi serumu ile PBS içinde hazırlanan ikincil antikorlarla bölümleri inkübe edin. Aşağıdaki gibi, ikinci antikorlar: keçi anti-fare Alexa546 1: 500, keçi anti-tavuk Alexa488 1: 500. </li><li> Daha sonra yavaş yavaş, bir cam lamel bölümleri kapsayacak, kuru bir cam slaytlar üzerinde bölümleri monte ve antifade montaj orta birkaç damla uygulanır. 4 ° C&#39;de slaytlar saklayın. </li><li> 1.3 sayısal diyafram ile 40X yağ daldırma lens ile bir konfokal mikroskop görüntüleri almak. </li></ol> 4. Konfokal [Ca 2 +] i Görüntüleme NOT: [Ca 2+] i 0.8 sayısal diyafram ile 40X su daldırma objektif lens ile bir konfokal mikroskop kullanılarak yapıldı görüntülenmesi. <ol><li> 2 ml başına - sa 1 ila 5 kayıt bölümü içinde, bir yer dilim dilimleme ve 1 akış hızında oda sıcaklığında oksijenli bir kayıt tamponu superfuse sonraMin. Sonra deney sırasında hareketini en aza indirmek için dilimin üstüne naylon dizeleri ile bir platin arp yerleştirin. </li><li> Görselleştirmek ve 10X suya daldırma hedefi altında parlak bir alan luminesansın ile dorsal striatum bulun. </li><li> 40X suya daldırma objektif lens geçmek ve Argon lazer 488 nm hattı açın. Odak düzlemi değiştirerek, soma, şube ve ağızları bazal floresan görüntüleme, yaklaşık 20 mikron dilim yüzeyinin altında bulunan hücreleri bulmak. Notun tehlikeye hücreler genellikle kaçınılmalıdır ortalamanın üzerinde floresan seviyesi, gösterir. </li><li> Taramayı başlatmak için &#39;çerçeve tarama&#39; modunu kullanın. Genellikle, 0.5 ayarlanmış lazer yoğunluk - maksimum çıkış% 5 [Ca2 +] sito-GCaMP3 ile görüntü yeterlidir. Astositlerin bütün topraklarında [Ca 2 +] i dinamiklerini izlemek için, çerçeve ya da daha hızlı başına 1 sn tarama hızı ile &#39;Çerçeve Tarama&#39; recomme olduğunuNDED, ancak bu durum, sözkonusu deneye bağlı olarak karar verilmesi gereklidir. </li><li> Görüş tüm alanında 2 astrositler - 1 izlemek için 3 kat - Gerekirse, görüntü için [Ca 2 +] i süreçlerinde, 2 dijital büyütme kullanmak. </li><li> Kayıt sırasında doymuş piksel önlemek için, hücreleri PseudoColor için &#39;Hilo&#39; arama modunu kullanın. Her zaman kırmızı renk doygunluğu göstergesi olarak görünür olmadığını test etmek için, yaklaşık 5 dakika boyunca bir &quot;pilot kayıt&quot; ile başlar. Eğer öyleyse, lazer çıkış gücünü düşürecek, ya da PMT alt / Kazanç / ofset değerleri ve piksel değerleri olmayan doymuş aralıkta test etmek için bir başka pilot kayıt yapmak. - 5% (10 mW), PMT 550-650 Volt, Kazanç 2.0 - lazer gücü 0,5 3.5x ve ofset 0: Tipik haliyle, bir araya getirilen parametrelerin görüntüleme astrosit için kullanılan [Ca2 +] striatumda I aşağıdaki gibidir -% 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen yöntemler, US yerinde daha sonra [Ca2 +] görüntüleme için in vivo striatal astrositlerde sito-GCaMP3 ifade etmek için izin vermektedir. Bu yöntem transgenik veya sağlam hedeflenen protein, hızlılık ifade ve deneysel uygulama ve anatomik özgüllük esnekliği dahil knock-fareler kullanılarak üzerinde avantajlara sahiptir. AAV2 / 5 ile GCaMP3 ekspresyonu spesifik ve güçlü olduğu bulundu. Serotip 5 AAV ile GFAP GfaABC 1 D ilerleticinin...

Astrositler beynin her yerde ve bol miktarda glial hücreler bulunmaktadır. İyi astrocytes hayati destek ve hücre dışı boşlukta K + konsantrasyon tamponlama, alımı nörotransmitterlerin sağlamanın yanı sıra besinlerin de dahil olmak üzere homeostatik rolleri hizmet ettiğini kurulmuştur. Ancak son çalışmalar onlar da kendiliğinden ortaya çıkar ve nöronal aktivitenin 1 artmıştır [Ca 2+] i sinyallerini görüntülemeye olduğunu göstermektedir. Astrosit varlığı [Ca 2 +] i sinyal giderek nöronlar ile iletişimi tetiklemek için düşünülmüş, ve gibi astrositlerden içinde &quot;Ca 2+ uyarılabilirliğinin&quot; bir formu olarak yorumlanmıştır. Son iki yılda mevcut veriler astrocytes ve nöronlar belki iki yönlü bir tarzda, iletişim kurabileceğini iki ayarları öneririz. İlk olarak, astrositlerin sıklıkla nörotransmiterler ve aktive [Ca2 +] artışa yanıtnöronlar 2 serbest nöromodülatörler. İkinci olarak, [Ca2 +] astrositler içine dahil artışlar da nöronlar ve kan damarlarını etkileyen astrositlerden sinyal molekülleri salınımına neden olur. Kanıt astrositlerden salınan moleküllerin astrosit-to-nöronun sinyalizasyonu ile sinaps, devreler ve sonuçta davranış 3-5 işlevlerinde değişikliklere yol açtığını göstermektedir. Ancak, bu hızla gelişmekte olan bir araştırma alanı kalır ve astrosit daha iyi ve ayrıntılı bir anlayış [Ca 2 +] i mevcut belirsizliklerin 6 bazı çözmek için gerekli olduğu ileri sürülmüştür. Geçmiş çalışmalarında, astrositlerde içine organik Ca 2+ gösterge boyaların toplu yükleme güvenilir algılamak için başarısız olduğu gösterilmiştir [Ca 2+] kültür ve yerinde 7-10 tüm astrositlerde içinde i sinyaller. Bu bulgular bize ve diğerleri 6,11,12 tarafından tartışılmıştır. Emerging resim [Ca 2 +] i nöronlar ve kan damarları ile etkileşimleri için birincil siteleri astrocyte süreçler (örneğin, şube ve ağızları), içinde sinyaller, nadiren ayrıntılı olarak incelenmiştir olmasıdır. Son zamanlarda, örneğin sitosolik GCaMP3, GCaMP5G ve GCaMP6 ve plazma zar olarak bulunan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) &#39;nin kullanımı, bağlı versiyonlar (örneğin Lck-GCaMP3) astrositlerin bu küçük bölümlerinde [Ca2 +] sinyalleri çalışma izin vermiştir gibi ince süreçler, plazma zarı yakın ve tüm toprakları 7,8 içinde. Bununla birlikte, Geçiş organik Ca 2 + göstergesi boyalar üzerinde bir dezavantajı vardır ve Geçiş uygun olarak ifade etmek için genetik yöntemler haftalık dönemler için in vivo olarak astrositleri seçici kodlayan genlerin sunmak için bu gerekliliktir. In vivo ifadesi tipik knock-fareler veya virüs bazlı teslimat uygulaması ile, transgenik fareler kullanılarak elde edilirHamam böcekleri. Mevcut jove makalede, adeno-bağlantılı virüsler kullanarak çizgili astrositlere Geçiş sunmak için kullanılan yöntem ve prosedürler rapor etmektedir. Biz örnek olarak cyto-GCaMP3 odaklanmak, ancak aynı temel prosedürü diğer Geci veya floresan protein bazlı muhabiri herhangi için çalışır.

<table><tbody><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>syringe needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virus</td><td>UPenn vector core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan red IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopes</td><td>Olympus</td><td>FV300 and FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-s100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-glutamine synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-chicken-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Striatumda sito-GCaMP3 arasında astrosit spesifik ekspresyonu sağlamak için, daha önce, sağlam GCaMP3 ve raportör geni tahrik etmek için gösterilmiştir, adeno-bağlantılı virüs (AAV) 5 serotip ve GFAP GfaABC 1 D yükseltici (Şekil 1A), kullanılan hipokampal ve kortikal astrositlerde 8,14 anlatım. İki hafta fare striatumu içine, virüs mikroenjeksiyon sonra fare (~ 10 haftalık), perfüze edilmiş ve IHC striatum (Şekil 1B) sito-GCaMP3 ekspresyonun...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Görüntüleme hücre içi Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K Görüntüleme.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

Video: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Nörobilim

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biyoloji

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

Kalsiyum Görüntüleme Tekniği ile Nöron-Glia Devresindeki Değişimlerin Görselleştirilmesi

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Görüntüleme hücre içi Ca

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler