This work was supported by the National Institutes of Health grant 5R21AI081041-02 and Georgetown University.

İki A. 1. Larva Yetiştirme albopictus Grupları Erişkinliğe <ol><li> İki optimum diapause ifadesi 16 21 ° C&#39;de programlanabilir aydınlatma ile fotoperiyot dolapları ve yaklaşık% 80 bağıl nem ayarlayın. <ol><li> Bir 16L Program bir kabine: 8K ışık: karanlık döngüsü (non-diapause LD fotoperiod uyaran). Bir 8L ikinci kabine ayarlayın: 16D ışığı: karanlık döngüsü (uyarıcı diapause) 13. </li><li> Her iki dolapları aynı zamanda Programın &#39;ışıklar&#39; fotoperiyodların arasındaki sirkadiyen zaman senkronize etmek. </li></ol></li><li> Deney gerçekleştirmek için gerekli yumurta miktarını hesaplayın. Kafes başına 300-500 yumurta hedefleyin. En azından üç diapause kafesleri çoğaltmak ve olmayan üç-diapause kafesler RNA üretimi için gerekli olan çoğaltmak. Bu deney başına 1,800-3,000 yumurta Takriben için toplamları. <ol><li> Yaklaşık içine deiyonize H 2 O 500 ml yumurta kağıtları daldırarak tarafından Hatch yumurta </li><li> Ekle &lt;em&gt; ca. Zemin köpek maması ve tuzlu su karidesi oluşan 1 ml gıda bulamaç olarak daha önce 24 nitelendirdi. Kafes ile konteyner örtün ve bir lastik bant ile yerine örgü tutmak. </li><li> Yaklaşık 24 saat LD fotoperiyodun kabine yerleştirin. </li></ol></li><li> Aktarım yumurtadan larva için 10 x 10 x 2 cm&#39;lik Petri yaklaşık 90 ml ile doldurulmuş kaplar deiyonize H2O <ol><li> Tabak başına yaklaşık 30 larva koruyun. Örneğin, her Pazartesi, Çarşamba, Cuma ve (MWF) 24 yemeklere her 48-72 saat temizlemek için larva aktarın. </li><li> Daha önce olduğu gibi, iyonu giderilmiş su içinde ezilmesi köpek maması ve tuzlu su karidesi her MWF oluşan besleme yaklaşık 1 mi gıda bulamaç 24 tanımladı. </li></ol></li><li> Her kafes biyolojik çoğaltmak içermektedir her fotoperiyod tedavisi için 3-4 yetişkin kafesleri ayarlayın. <ol><li> 9.5 L kovalar ters taraftan, bir 10-by-14 cm delik kesip, ve 15 cm çapında bir delik. Comesh ile ilk Sür. Ortopedik çorap yaklaşık bir ayak uzunluğu kesin, ve diğer deliğin içine etrafında bir ucunu tutkal. </li><li> Çorap kapalı ve düğüm kapatma ayak ucunu kesin - kafesin iç erişim gerektiğinde yalnızca açık. Kafes kapak için, sadece jant bırakarak, tüm iç kesip, ve örgü 24 ile iç plastik değiştirin. </li><li> Kafesin tarafında kalıcı bir kalem ile deney ile ilgili numarayı, kafes başlangıç ​​tarihini ve diğer bilgileri çoğaltmak, fotoperiod unutmayın. </li></ol></li><li> Islak filtre kağıdı ile yetişkin kafesleri alt Hat. Filtre kağıdı 24 ovipozisyon teşvik, hangi kafeste yerel nem oranı yükselir, ancak suya durmaktan kaçınmak için yeterli deiyonize H 2 O ile filtre kağıdı nemlendirin. Gerektiğinde kurutulması için günlük olarak tekrar nemli filtre kağıdı edin. </li><li> En az 100 kadın dahil, bir RNA kütüphanesi için yeterli yumurta üretmek için / 9.5 L cage, kafes başına en fazla 500 sivrisinek ile. </li><li> En fazla 50 pupa başına 25 mi H2O yoğunluğunda, temiz H2O küçük bir kap içinde pupa MWF yeri ve toplamak Bir yetişkin kafesine pupa fincan aktarın. İlgili fotoperiyodun kabine yerleştirin kafesleri - A. albopictus pupa 15 fotosensitiftir. </li><li> Ölü pupa oluşumu kitle mortaliteye neden olabilir, çünkü, bardak H 2 O temiz ve berrak olduğunu günlük olun ve ölü pupa çıkarın. Tüm pupa ortaya Ey bardak sonra H 2 çıkarın. </li><li> Ortaya yetişkinler için şeker sağlamak için kafesin üst örgü organik üzüm yerleştirin. Üzüm Monitör ve küf birikmesini önlemek için her 3-5 gün onları değiştirmek. </li></ol> Yetişkin 2. Bakım Çiftleşme ve Yumurta Üretim izin ver <ol><li> (SECTI nemli bir filtre kağıdı ile kafes alt astar yüksek nemde (yakl.% 80) en kafesleri bakımı, ve yukarıda tarif edildiği gibi, küflü üzüm erişim sağlamakons 1.5 ve 1.9). </li></ol> 3. Kan-besleme <ol><li> Yumurtlama yaklaşık 100% diapause yumurta 14 başlamadan önce kadın en az sekiz net kısa gün maruz emin olmak için eclosion sonra 2-6 gün arasında kan besleme kadınlarda hazırlanın. </li><li> Hemotek Membran Besleme sistemi hazırlayın. Güç kaynağı besleyen birimleri takın. Ayar vidası kullanarak 37 ° C her biriminin sıcaklığını ayarlayın. Kalibrasyon sırasında besleme ünitesinin sıcaklığını ölçmek için bir elektronik termometre ve probu kullanın. </li><li> Yemek haznesini hazırlayın. Yemek rezervuar diyafram üzerinde kollajen besleme membranın bir kare gerin ve bir O-ring ile sabitleyin. Dikkatle kırışıklıkları kaldırmak için köşeleri çekin; makas ile aşırı membran düzeltin. NOT: Kollajen membran tüm sivrisinek türleri için de işe yaramayabilir ve bir çalışma varsa optimum membran bulmak için çeşitli denemek için gerekli olabilirA dışında başka türler albopictus. Parafilm pipiens&#39;in ile iyi çalışır. <ol><li> Kan kullanmadan önce en az 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, dondurulmuş çözülme saklanır. </li><li> Membran aşağıya bakacak şekilde tutun rezervuar, desteksiz ve dolum portları yukarı bakacak. Bir anti-pıhtılaştırıcı olarak sodyum sitrat olan tavuk tam kan, yaklaşık 3 ml ile doldurulması için bir transfer pipeti veya şırınga kullanın. Plastik fişler ile dolum noktalarını Seal. </li></ol></li><li> Besleyici altındaki ısı transfer plaka üzerinde damızlık üzerine vidalanarak besleyici hazırlanan rezervuar takın. Sivrisinekler kafesin örgü ile besler, böylece besleyici ters çevirin ve kafesin üst, aşağı membran tarafına yerleştirin. Besleme en üst düzeye çıkarmak için yaklaşık 45 dakika boyunca kafes üzerine besleyici tutun. </li></ol> 4. yumurtlama teşvik <ol><li> Dört beş gün renkli bir karanlık her kafes donatmak, kan yemek sonrası 50 ml cağartılmamış tohum çimlenme kağıdı (yumurta kağıt) veya dokulu olmayan ağartılmış kağıt havlu ile kaplı ve deiyonize su ile 9 yarıya doldurun kadar. 250&#39;den fazla sivrisinek bir kafes içinde iseniz, iki bardak kullanın. NOT: Küçük kafeslerde veya tek dişi şişeleri için, yumurtlama kaplarda &quot;hay infüzyon&quot; nedeniyle mikrobiyal floranın 25 koku ovipozisyon artabilir. </li></ol> 5. toplayın ve Mağaza Yumurta <ol><li> Yumurta üretimi genellikle önümüzdeki hafta boyunca azalır, sonra beş gün kan beslenme sonra yaklaşık zirveleri, çünkü kan besleme 4-5 gün içinde yumurta toplama başlar. </li><li> Deneyin ihtiyaçları yumurta toplama sıklığını Vary. Genel amaçlar için, bir MWF programa yumurta kağıtları toplamak. Her kafes yumurta kağıtları çıkarın ve taze kağıt ile değiştirin. Yumurta depolama karıştırıcı etkilerini önlemek için SD fotoperiyodun kabinesinde Petri kapları ve mağaza son zamanlarda kaldırıldı kağıtları yerleştirin. </li><li> Yumurta kağıtları yeniden izin<html> Yumurta kuruma direncini artırır 26 serozal manikür oluşumuna, izin sonrası yumurtlama 2 gün boyunca ıslak ana. </li><li> Yaklaşık 48 saat sonra toplama, açık havada kuru yumurta. Kağıt H 2 O koyu veya yumurta yumurtadan uyaran o kadar ıslak gevşek ve hafifçe nemli, ama öyle ki kağıt kurutun. NOT: Bir 6,5 &quot;x 4&quot; Kağıt kuruması yaklaşık 3.5 saat sürebilir. Bu yumurta kuruma 27 neden olacak gibi değil, aşırı kuru yumurta kağıtları dikkatli olun. </li><li> LD ve SD hem fotoperiyodların rezerv ek yumurta diapause insidansını değerlendirmek ve (Diapause Ölçme Bölüm 6) photoperiodic etkisini yorumlamak. </li><li> Uzun süreli depolama için, 21 ° C&#39;de yumurta kağıtları tutmak ve Petri kutularına yaklaşık% 80 nem. Embriyo gelişimi, 21 ° C&#39;de 4-5 gün sürer, yerel nem korumak için bir su şişesi ile bir Saklama kabı depolama kabı içinde Petri kapları tutun. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Diapause İnsidans Tedbir <ol><li> Ek saklıdır embriyolar diapause yanıtı ölçmek için 7-20 gün eski (yumurtlama, Bölüm 4 Canlandıracak bakınız) kullanın. </li><li> Her yumurta kağıt üzerinde bulunan yumurta sayısını kaydedin. </li><li> Tamamen yaklaşık 80 ml ​​deiyonize H 2 O ile 90 ml&#39;lik Petri kabındaki bireysel yumurta kağıtları daldırarak yumurtadan yumurta teşvik Yaklaşık 0.25 mi gıda bulamaç ekleyin. </li><li> 24 saat sonra ince çizgiler birinci değişim safhasındaki larva sayısı kalın. Larvaları görselleştirmek ve çanağın bir tarafında bir ışık kaynağı yerleştirmek için siyah bir yüzey Petri tabağına yerleştirin. Larva bireysel larva net bir taksitli için izin ışık kaynağından uzak hareket edecek. Bireysel larva anlatırken önlemek için sayım sırasında bir pipet ile bireysel larva çıkarın. </li><li> Yeni bir Petri kabı ve yeniden-kuru yerleştirin yumurta kağıtları. Yeniden yumurtadan yumurta yine ~ 1 hafta ve sonra yukarıdaki yöntemi kullanarak yumurtadan yumurta taksitli. </li><li> Kalan u Yeri yumurta kağıtları<html> Yaklaşık 80 ml ​​beyazlatma solüsyonu 28 ml 90 yeni Petri kapları yumurta n-yumurtadan. Yumurta kağıtları tamamen ağartma çözeltisine batırılmış emin olun ve çamaşır suyu kokusunu önlemek için bir davlumbaz gecede altında bırakın. NOT: Bu maddeler, 4 ° C&#39;de yaklaşık 1 hafta boyunca muhafaza edilebilir, ancak aksi takdirde taze yapılmalıdır. </li><li> Koryon temizlemek ve embriyo, un-yumurtadan yumurta görselleştirme sağlayacak beyazlatma gibi bir ışık mikroskobu kullanılarak yumurta kontrol edin. Yumurta embriyolu ise yumurta sırt tarafında birbirine zıt iki küçük siyah noktalar şeklinde görünen gözlü grimsi beyaz bir renge sahip olur. Un-taranmış, embriyonlu yumurta 13 sayısını taksitli. </li><li> Hayır =% diapause: Aşağıdaki formül ile diapause sıklığını belirler. embriyone un-yumurtadan yumurta / (hayır. yumurtadan yumurta + hayır. embriyone un-yumurtadan yumurta) 100 13 x. </li></ol> Yumurta / pharate Larvalarına 7. RNA Ekstraksiyon &quot;ontent&gt; NOT: Bir laminer akış kaputu kullanın Trizol. <ol><li> Bir deve tüyü fırça kullanarak cam taşlama için yumurta kağıtları farklı gelişim zaman noktalarında gelişen embriyolar ya pharate larva içeren Fırça sivrisinek yumurtaları. Tamamen toz haline gelene kadar Trizol yumurta (doku 50-100 mg başına 1 mi) öğütün. Yeterli RNA elde kütüphanede başına en az 400 yumurta kullanın. <ol><li> Seçenek olarak ise, sıvı azot içinde dondurularak yumurta bileşenini ve Trizol taşlama önce bir ay kadar için mikrosantrifüj tüpleri içinde -80 ° C&#39;de saklandı. </li></ol></li><li> Trizol RNA ekstraksiyonu yapın, üreticinin talimatlarına uygun olarak, izopropanol çökeltme eklenmiştir. </li><li> RNA, bağlı bozulmayı önlemek için herhangi bir kalıntı nükleazlar kaldırmak için RNaz dekontaminasyon çözelti ya da diğer maddeler ile birlikte tezgah tedavi edin. <ol><li> DNase ile ekstre RNA tedavi edin. Üreticinin talimatlarına göre, 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca DNaz ile RNA örnekleri inkübe edin. 1 &amp; # kullanın181; 50 ml&#39;lik bir reaksiyon içinde RNA kadar 10 ug l DNaz. Bir reaksiyonda RNA fazla 10 ug varsa DNase miktarını artırır. </li><li> 5 ul askıya DNaz inaktivasyon reaktif ekleyerek DNase inaktive. Kuluçka döneminin (hafif girdaplama) sırasında üç kez karıştırma, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 1.5 dakika için 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Sonraki adımlar için yeni tüplere tedavi RNA örnekleri ihtiva eden üst sıvıyı aktarın. </li></ol></li><li> Fluorometri toplam RNA örneklerinin kalitesini değerlendirmek. Bu görev için uygun alet ile bir özel tesisine örnekleri gönderin. Tesis çip aşılanan floresan boya ile görüntülendi numune RNA türlerinin, boyutlarını belirlemek için çip jel elektroforezi gerçekleştirecektir. Sonuçlar bir electropherogram olarak iade edilecektir. <ol><li> Varlığı o tarafından kanıtlandığı gibi, varlığında veya bozunma ürünlerinin yokluğunda toplam RNA numunelerinin bütünlüğünü belirlemekElde electropherogram (Şekil 1B) üzerinde 18S ve 5S ribozomal RNA zirveleri arasında f zirveleri. </li></ol></li></ol> 8. RNA Sıralama <ol><li> Standart protokolleri takip zenginleştirilmiş eşleştirilmiş-uç mRNA kütüphaneleri ve mRNA sıralama, yapımı için ticari bir sıralama merkezi yeterince yüksek kalitede (Şekil 1A) ve miktarı (kütüphane başına genellikle&gt; 3 mg) ile toplam RNA örnekleri gönderin. </li><li> Birden fazla şeritli bir tek deney sıralanması için kullanılan ediliyorsa, sıralama sırasında şerit arasında teknik varyasyon için hesap sıralama için iki şerit halinde bireysel kütüphaneler bölünmüş. </li></ol> 9. lllumina Oku Temizlik NOT: Şekil 2, bu protokolün biyoinformatik bölümünü özetlemektedir. Bu protokolün biyoinformatik bölümünde kullanılan tüm programlar ve kaynakların tam listesi için, Tablo 1 bakınız. InAyrıca, Ek Dosya 1 Aşağıdaki biyoinformatik protokol adımların her biri için komut satırı örneklerini içerir. <ol><li> NCBI UniVec Çekirdek veritabanına% 95 kimlik ya da daha yüksek bir eşleşme için ssaha2 29 (Tablo 1) kullanarak (Tablo 1), C. albopictus rRNA dizi (Gen Bankası # L22060.1), ve sıralama adaptörleri (Ek Dosya 1&#39;de verilmiştir Ayrıntılı komut satırı örnekleri). Sağlanan Perl script (Ek Dosya 2) adapte örneğin Perl kullanarak maçlarda veya benzeri bir komut dosyası aracı ile okuma çiftleri çıkarın. </li><li> Kalan Temiz SolexaQA paketiyle 30 okur (Tablo 1; Ek Dosya 1): DynamicTrim.pl varsayılan ayarları kullanarak 20&#39;den daha az bir phred puan eşdeğeri olan bölgeleri kırpın. <ol><li> Kaldır ileri hem LengthSort.pl ile daha kısa 25 bp okur ve ters aynı anda okur. FastQC (Tablo 1 ile fastq temizlenen dosyaların kalitesini değerlendirmek </stRong&gt;) - Özellikle, başına tabanı dizisi kalitesi ve başına dizisi kalitesi puanları 20&#39;nin üzerinde olduğunu doğrulayın. </li></ol></li></ol> 10. Dijital Normalleştirme <ol><li> K-mer boyutu 20, 20 bir kapsama kesme, ve x kullanarak (özellikle normalize-by-median.py; (Ek Dosya 1 Tablo 1) khmer aracını kullanarak 31 okur temizlenmiş dijital normalleşme bir tur yapın = 1E10). </li><li> Yüksek RAM ile bir makine mevcut (GBS yüzlerce) ise Alternatif, Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl komut (Tablo 1) kullanın. </li></ol> 11. De Novo Transkriptom Meclisi <ol><li> Montaj büyüklüğüne bağlı olarak, RAM kadar 256 Gb ve 24 işlemcilerde olan bir bilgisayar veya bilgisayar kümeye erişimi edinin. </li><li> Komşularla içine yerleştirilen dijital normalize okuma monte etmek, Trinity 32 (Ek Dosya 1 Tablo 1) kullanın. Azaltmak için,bellek kullanımı, --min_kmer_cov 2 kullanın. </li></ol> 12. Meclis Değerlendirme <ol><li> Trinity kontig çıkış Assemblathon2 projesi 33 assemblathon_stats.pl çalıştırın. (; Ek Dosya 1 Tablo 1) Bu script gibi iskelelerinin sayısı, N50, montaj kompozisyon, ve daha fazlası gibi değerlendirilmesi montaj kalitesi ile ilgili temel hesaplamaları gerçekleştirir. </li></ol> Montajlı transcriptome 13. Ek Açıklama <ol><li> Bir referans protein kümesi karşı toplanma BLASTX (Tablo 1) gerçekleştirin; sivrisinekler için, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens ve Aedes aegypti uygun referanslar vardır. Özellikle, BLASTX (Ek Dosya 1) takip patlamanın referans protein Fasta dosyasını, biçimlendirmek. </li></ol> 14. Harita RSEM 34 Kullanma Meclise okur (Tablo 1) <ol><li> Bir &#39;transkript-to-gen haritasının&#39; dosyası oluşturun hangiİlk sütun referans gen kimlikleri ve ikinci sütun kontigi kimlikleri içeriyor. Bir elektronik tablo editörü olarak, BLASTX çıkışından birinci ve ikinci sütun takas ve bir .txt dosyasına bu sütunları yazın. Unix formatına sonuçlanan .txt dosyasında satır sonlarını dönüştürmek için lineBreak programını kullanın. </li><li> RSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan rsem-hazırlamak-referans komut kullanarak transcriptome Fasta dosyasından bir başvuru dataset oluşturun. </li><li> RSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan rsem-hesaplamak ifade komutunu kullanarak her kütüphane için ayrı ayrı ifade değerlerini hesaplayın. Okur gibi, okuma-temizleme adım (adım 9.2) kaynaklanan fastq eşleştirilmiş dosyaları kullanın. <ol><li> Biyolojik tekrarında RNA dizileme için iki şerit bölünmüş ise, tek bir dosya oluşturmak için ifade hesabında hem fastq dosyaları içerir. </li></ol></li><li> Kolayca diğer p tarafından işlenen bir matris her kütüphaneden ifade sonuçlarını dönüştürmeRSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan sağlanan komut rsem-oluşturmak-veri-matris kullanarak rograms. </li></ol> 15. Diferansiyel İfade Analizi <ol><li> R ve Edger (Tablo 1) takın. </li><li> Adım 14.3 (Ek Dosya 1) den RSEM sonuçlarını yüklemek için read.delim kullanın. Gerekirse, en yakın tam sayıya sayıları yuvarlak. NOT: Kenar düzeninin kılavuzu önemini algılamak için yeterince yüksek bir ifade ile genlere veri kümesi sınırlayan önerir. </li><li> Edger için verileri biçimlendirmek için, yüklenen veri dosyası (Ek Dosya 1) bir DGEList nesnesi oluşturur. Ardından, TMM normalleştirme (Ek Dosya 1) kullanarak veri normalleştirmek. Veri (Ek Dosya 1) ortak ve tagwise dağılımlarını tahmin. </li><li> Bir Benjamini-Hochberg ile farklı ifade genleri tanımlamak p-değeri &lt;0.05 (Ek Dosya 1) düzeltildi. Bereket vs log-kat-değişim (Ek Dosya 1) dağılımını çiziniz. </li></ol>

<ol>
	<li>Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+of+gene+expression+in+extreme+cold+-+reference+transcriptome+for+the+high-Antarctic+cryopelagic+notothenioid+fish+Pagothenia+borchgrevinki.">Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki.</a> BMC Genomics. 14, 634 (2013).</li><li>Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+divergence+during+speciation+driven+by+adaptation+to+altitude.">Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude.</a> Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).</li><li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympatric+ecological+speciation+meets+pyrosequencing:+sampling+the+transcriptome+of+the+apple+maggot+Rhagoletis+pomonella.">Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella.</a> BMC Genomics. 10, 633 (2009).</li><li>Barshis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+basis+for+coral+resilience+to+climate+change.">Genomic basis for coral resilience to climate change.</a> P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).</li><li>Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+element+of+the+diapause+program+in+the+Asian+tiger+mosquito,+Aedes+albopictus,+identified+by+suppressive+subtractive+hybridization.">A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization.</a> J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duck+genome+and+transcriptome+provide+insight+into+an+avian+influenza+virus+reservoir+species.">The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species.</a> Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).</li><li>Sessions, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+transcriptome+profile+during+wild-type+and+attenuated+dengue+virus+infection.">Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).</li><li>Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+complex+mechanisms+of+diapause+preparation+in+the+invasive+mosquito,+Aedes+albopictus.">Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus.</a> P. R. Soc B. 280, (2013).</li><li>Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+sequencing+as+a+platform+to+elucidate+molecular+components+of+the+diapause+response+in+Aedes+albopictus.">Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus.</a> Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).</li><li>Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+transcriptome+of+the+Asian+tiger+mosquito,+Aedes+albopictus,+to+identify+candidate+transcripts+for+diapause+preparation.">A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation.</a> BMC Genomics. 12, 619 (2011).</li><li>Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+the+tiger:+Global+risk+of+invasion+by+the+mosquito+Aedes+albopictus.">Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus.</a> Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).</li><li>Lounibos, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasions+by+insect+vectors+of+human+disease.">Invasions by insect vectors of human disease.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).</li><li>Urbanski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+adaptive+evolution+of+photoperiodic+response+during+invasion+and+range+expansion+across+a+climatic+gradient.">Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient.</a> Am. Nat. 179, 490-500 (2012).</li><li>Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+evolution+of+photoperiodic+diapause+in+temperate+and+tropical+invasive+populations+of+Aedes+albopictus+(Diptera+Culicidae).">Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).</li><li>Mori, A., Oda, T., Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).</li><li>Pumpuni, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).</li><li>Wang, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+influence+of+photoperiod+on+egg+diapause+in+Aedes+albopictus+Skuse.">Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse.</a> Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).</li><li>Sota, T., Mogi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival-time+and+resistance+to+desiccation+of+diapause+and+non-diapause+eggs+of+temperate+Aedes+(Stegomyia)+mosquitoes.">Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes.</a> Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).</li><li>Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profiling+reveals+mechanisms+for+lipid+conservation+during+diapause+in+the+mosquito,+Aedes+albopictus.">Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus.</a> J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).</li><li>Andrewartha, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diapause+in+relation+to+the+ecology+of+insects.">Diapause in relation to the ecology of insects.</a> Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).</li><li>Danks, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+Dormancy:+An+Ecological+Perspective.">Insect Dormancy: An Ecological Perspective.</a> Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , (1987).</li><li>Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+diapause.">Regulation of diapause.</a> Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).</li><li>Rev Entomol, A. n. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 59, 93-122 (2014).</li><li>Armbruster, P. A., Conn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+of+larval+growth+in+North+American+Aedes+albopictus+(Diptera).">Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera).</a> Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).</li><li>Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+the+CDC+ovitrap+with+hay+infusions+for+daily+monitoring+of+Aedes+aegypti+populations.">Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations.</a> J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).</li><li>Rezende, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+desiccation+resistance+in+Aedes+aegypti:+presumptive+role+of+the+chitinized+serosal+cuticle.">Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle.</a> BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).</li><li>Munstermann, L., Crampton, J., Beard, C., C, L. o. u. i. s. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Care+and+maintenance+of+Aedes+mosquito+colonies.">Care and maintenance of Aedes mosquito colonies.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , 13-20 (1997).</li><li>Trpis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bleaching+and+decalcifying+method+for+general+use+in+zoology.">A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology.</a> Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).</li><li>Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSAHA:+A+fast+search+method+for+large+DNA+databases.">SSAHA: A fast search method for large DNA databases.</a> Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).</li><li>Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SolexaQA:+At-a-glance+quality+assessment+of+Illumina+second-generation+sequencing+data.">SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-Seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome.</a> Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).</li><li>Bradnam, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblathon+2:+evaluating+de+novo+methods+of+genome+assembly+in+three+vertebrate+species.">Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species.</a> GigaScience. 2, 10 (2013).</li><li>Li, B., Dewey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>White, B. N., De Lucca, F. L., Turner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+analysis+of+RNA.">Preparation and analysis of RNA.</a> Analytical Biochemistry of Insects. , (1977).</li><li>Hawley, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+Aedes+albopictus.">The biology of Aedes albopictus.</a> J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).</li><li>Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socioeconomic+status+affect+mosquito+(Diptera:Culicidae)+larval+habitat+type+availability+and+infestation+level.">Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level.</a> J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2,4,10.+Bloodfeeding:+Membrane+apparatuses+and+animals.">Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals.</a> Methods in Anopheles Research. , (2010).</li><li>Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dengue+infections+in+mosquitoes+(A.+aegypti)+and+infection+phenotype+determination.">Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination.</a> J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).</li><li>Goff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iPlant+collaborative:+cyberinfrastructure+for+plant+biology.">The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology.</a> Plant Sci. 2 (34), (2011).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).</li><li>Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCHIME+improves+sensitivity+and+speed+of+chimera+detection.">UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.</a> Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).</li><li>Goecks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible,+reproducible,+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences.">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol A indüklenen diapause photoperiodically nedeniyle farklı şekilde ifade edilen genleri bulmak için yöntemler sunulur albopictus. photoperiodic diapause yanıt odaklanan kişiler için özellikle - protokolü benzersiz acemi kullanıcılar için erişilebilir bir moleküler fizyoloji programın tüm deneysel yönlerini yapmak için sivrisinek yetiştirme ve biyoinformatik teknikleri birleştiren önemli olduğunu. Yetiştiricilik hataları tespit etmek genellikle gereklidir - - Mevcut y?...

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms1&#8211;3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change4, the spread of invasive species5, and host-pathogen interactions6,7.
The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.
Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism8&#8211;10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus15&#8211;17. Diapause eggs are more desiccation resistant5,18 and contain more total lipids19 than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect22. In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.
This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause23, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

<table><tbody><tr><td>Incubator - Model 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>Controlled environment room</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/</td></tr><tr><td>Cool Fluorescent bulb</td><td>Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>Petri Dish 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper 20.5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>9.5 L Bucket</td><td>Plastican</td><td>Bway Products</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>Utility Fabric-Mosquito Netting White</td><td>Joann</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>Orthopedic stockings</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>product no. 081420</td></tr><tr><td>Organic Raisins</td><td>Newman&#039;s Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>Oviposition cups (brown)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.</td></tr><tr><td>Recycled Paper Towels</td><td>Seventh Generation</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>Modular Mates Square Tupperware Set</td><td>Tupperware</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td>Glass Grinder</td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.</td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution &amp;#8212; this reagent is toxic.</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Place up to 12 RNA samples on one chip.</td></tr><tr><td>Hemotek Membrane Feeder</td><td>Hemotek&amp;nbsp;</td><td>5W1</td><td>This system&amp;nbsp; provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company&#039;s mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>Digital Thermometer and Probe</td><td>Hemotek&amp;nbsp;</td><td>MT3KFU</td><td>MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.</td></tr><tr><td>Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td><td>The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 &amp;#176;C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.</td></tr></tbody></table>

an experimental and bioinformatics protocol for rna-seq analyses of photoperiodic diapause in the asian tiger mosquito, aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

İki temsili RNA örneklerinin Florimetri (Şekil 1A, B) nt yaklaşık 2.000 iki bant gösterdi. böcek 28S ribozomal RNA, kolayca kısa ısıtma veya hidrojen bağları 35 bozan maddeler ile parçalanmıştır hidrojen bağları ile bir arada tutulan iki polinükleotid zincirlerinden meydana gelmektedir. Elde edilen iki bileşen yaklaşık 18S ribozomal RNA gibi aynı boyutta. ikinci RNA numunesi bozulması yüksek seviyelerde (Şekil 1B) göstermiştir. <p class="jove_c...

Watch this Scientific Journal Video about An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus at JoVE.com

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

an-experimental-bioinformatics-protocol-for-rna-seq-analyses

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

13.2K Görüntüleme.  Georgetown University. RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data. 

Video: An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Biyoloji

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Çevre

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin Sekonder Hücrelerinden RNA'yı Izole etmek için FACS tabanlı Protokol

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Genetik

Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, morphology, and behavior drastically from aquatic larvae to terrestrial/aerial adults without pupal stage. Odonata adults have a well-developed color vision and show a remarkable diversity in body colors and patterns across sexes, stages, and species. While many ecological and behavioral studies on Odonata have been conducted, molecular genetic studies have been scarce mainly due to the difficulty in applying gene functional analysis to Odonata. For instance, RNA interference (RNAi) is less effective in the Odonata, as reported in the Lepidoptera. To overcome this problem, we successfully established an RNAi method combined with in vivo electroporation. Here we provide a detailed protocol including a video of the electroporation-mediated RNAi method as follows: preparation of larvae, species identification, preparation of dsRNA/siRNA solution and injection needles, ice-cold anesthesia of larvae, dsRNA/siRNA injection, in vivo electroporation, and individual rearing until adult emergence. The electroporation-mediated RNAi method is applicable to both damselflies (suborder Zygoptera) and dragonflies (suborder Anisoptera). In this protocol, we present the methods for the blue-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) as an example of damselfly species and the pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) as another example of dragonfly species. As representative examples, we show the results of RNAi targeting the melanin synthesis gene multicopper oxidase 2. This RNAi method will facilitate understanding of various gene functions involved in metamorphosis, morphogenesis, color pattern formation, and other biological features of Odonata. Moreover, this protocol may be generally applicable to non-model organisms in which RNAi is less effective in gene suppression due to the inefficiency and low penetrance.

We provide a detailed protocol for electroporation-mediated RNA interference in insects of the order Odonata (dragonflies and damselflies) using the blue-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) and the pied skimmer dragonfly (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Odonata'da Elektroporasyon aracılı RNA Girişim Yöntemi

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, ...

Gelişim Biyolojisi

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with an attractive off-target profile at both cellular and organismal levels. It is recently reported that the CRISPR/CasRx system can be used to achieve ubiquitous and tissue-specific gene transcript reduction in Drosophila melanogaster. This paper details the methods from the recent work, consisting of three parts: 1) ubiquitous&#160;in vivo endogenous RNA targeting using a two-component CasRx system; 2) ubiquitous in vivo exogenous RNA targeting using a three-component CasRx system; and 3) tissue-specific in vivo RNA targeting using a three-component CasRx system. The effects of RNA targeting observed include targeted gene specific phenotypic changes, targeted RNA transcript reduction, and occasional lethality phenotypes associated with high expression of CasRx protein and collateral activity. Overall, these results showed that the CasRx system is capable of target RNA transcript reduction at the organismal level in a programmable and efficient manner, demonstrating that in vivo transcriptome targeting, and engineering is feasible and lays the foundation for future in vivo CRISPR-based RNA targeting technologies.

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

This article outlines a detailed protocol for using the RNA-targeting Cas13D enzyme (RfxCas13D) in flies.

CRISPR/CasRx kullanarak Drosophila Melanogaster'da Her Yerde ve Dokuya Özgü RNA Hedeflemesi

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus on one or more gene families that are significant to the organism and study. In this protocol, we outline bioinformatic steps to generate a phylogeny and to quantify the expression of genes of interest. Phylogenetic trees can give insight into how genes are evolving within and between species as well as reveal orthology. These results can be enhanced using RNA-seq data to compare the expression of these genes in different individuals or tissues. Studies of molecular evolution and expression can reveal modes of evolution and conservation of gene function between species. The characterization of a gene family can serve as a springboard for future studies and can highlight an important gene family in a new genome or transcriptome paper.

The purpose of this protocol is to investigate the evolution and expression of candidate genes using RNA sequencing data.

RNA-seq Kullanarak Moleküler Evrimi ve Gen ekspresyonını Araştırmak için Biyoinformatik Boru Hattı

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin Sekonder Hücrelerinden RNA'yı Izole etmek için FACS tabanlı Protokol

Odonata'da Elektroporasyon aracılı RNA Girişim Yöntemi

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması

CRISPR/CasRx kullanarak Drosophila Melanogaster'da Her Yerde ve Dokuya Özgü RNA Hedeflemesi

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama

içine RNAi Tetik Teslimat

RNA-seq Kullanarak Moleküler Evrimi ve Gen ekspresyonını Araştırmak için Biyoinformatik Boru Hattı