Bu çalışma aşağıdaki gelen RAW fon tarafından desteklenmiştir: Ulusal Sağlık Enstitüleri K01 DK083512, DP2&#39;deki OD008470, ve R01 DK100237 verir; Dimes Basil O&#39;Connor Başlatan Bilgin hibe # 5-FY12-75 Mart; Bilim ve Biyolojik Bilimler Bölümü Notre Dame Koleji Üniversitesi&#39;nden fon başlatmak; ve Gallagher Ailesi adına Elizabeth ve Michael Gallagher Notre Dame Üniversitesi cömert bir hediye kök hücre araştırmaları teşvik etmek. Maliyeciler çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz onların destek için Biyolojik Bilimler Bölümü kurmayları teşekkür ederiz ve bizim zebrabalıkları koloninin bakım ve refah onların üstün özveri için Notre Dame de Zebra Araştırma Merkezi. Son olarak, bu çalışma konusunda yorumlar, tartışmalar ve anlayışlar için bizim araştırma laboratuvarında üyelerine teşekkür ederim.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada, biz yetişkin zebrabalıkları nefron segmenti bileşenlerin görselleştirme izin yöntemler tarif etmişlerdir. Floresan dekstran konjügatların enjeksiyonu bu proksimal tübül hücrelerinin 30,38 endositik özellikleri nedeniyle tercihli PCT etiketleme sağlar. Bu yöntem, farklı floresan konjugatlarının bir kuş sürüsü ile elde edilebilir dekstranlar varlığından büyük bir esneklik ile yapılabilir. İkinci etiketleme işlemleri gerekli değildir Buna ek olarak, lizin tamir edilebilir dekstranlar kullanımı PCT kesimleri etiketlemek için özellikle uygun bir yoldur. Bu, nispeten basit bir sinyal tespit edilmesini sağlar ve diğer birçok floresan etiketler, immunolabeling ve raportör transgenik çizgiler kullanımı ile uyumludur. Alkalin fosfataz Etiket aynı zamanda, PST PCT güçlü reaktivite ve biraz daha zayıf bir reaktiviteye sahip, proksimal tübül işaretler. Son olarak, DBA boyama bir ch gösterilecek uzak tübül segmentlerinde, etiketleme sağlararacteristic morfolojisi dallıdır. Immün olmayan kökenli, şeker bağlayıcı proteinler olan çeşitli lektin molekülleri, memeli nefron kesimleri 47 ayırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. O memeli böbreklerde 47. toplama kanalları işaretlemek için kullanılır gibi zebrabalıkları DBA, distal tübül kesimleri ile korelasyon olması ilginçtir. Birlikte ele alındığında, bu yöntemler, böbrek bileşimi ve işlevini belge çeşitli kombinasyonlar halinde kullanılabilir. Bu yöntemlerin hepsi tüm böbrek hazırlıklar kullanılabilir beri, tamamen daha fazla zaman tüketen, sıkıcı yöntemlerle, örneğin, cryosection iş ve immunolabeling kullanımına dayanmadan organın her nefron yapısını ve fonksiyonunu değerlendirmek için araçlar sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, makalede açıklanan lekeleri cryosection olarak geçerli değildir. Cryosection analizi immünohistokimyası belirli peptidleri algılamak için daha uygundur (bütün montaj kıyasla) örnekleri oluştururDES, ancak elbette bu tip analiz uygun bir birincil antikor kullanılmasını gerektirir. Ne yazık Zebrafish hayvan modeli ile çalışan bir büyük sınırlama antikorların düşük mevcudiyet kalır. Böylece WİSH yani, en yaygın olarak kullanılan kalır &#39;git, gen ekspresyonunun analizi için prosedür. Mor veya kırmızı çökeltileri üretmek için BCIP NBT ve / veya INT substrat reaksiyonlar kullanarak DİLERİZ cryosections floresan boyama ile uyumlu değildir. Bir seçenek floresan WİSH tespiti, zebra balığı embriyonik örnekler için optimize edilmiş olan ve yetişkin böbreğinin kullanım için uygun olabilir bir prosedürün kullanımı çağırmak olacaktır. Bu video makalede yöntemlerin açıklaması ayrı ayrı bölümler gibi eGFP veya mCherry gibi bir muhabir ile etiketlenmiş edildiği transgenik zebrafish hatları ile birlikte floresan, WISH gibi teknikler ile daha fazla deneyler için izin vermelidir. Alternatif olarak, yöntemler, burada tarif edilen edebildiğidiğer hayati boyalar, örneğin, diğer lektinlerin ile kombinasyon halinde test edilebilir d. Böylece, daha fazla uyum ve burada açıklanan yöntemlerin genişleme bütün montaj böbrek hazırlıkları ve analiz için araştırmacının ihtiyaçlarına göre çağırılacak. Bu durumda, bu yöntemler, devam eden yenileme çalışmaları için Zebrafish modeli ile birlikte uygulanması için ve genetik hastalığın modelleme geniş bir potansiyele sahiptir. Böbrek hatalarımız için yenilikçi araştırma ve tedaviler için acil bir ihtiyaç vardır. Milyonlarca insan, konjenital akut ve / veya kronik nedenlerden kaynaklanan her yıl böbrek hastalığı çeşit muzdarip. Ayrıca, böbrek hastalığı prevalansı bu hastalıkları küresel bir halk sağlığı sorunu 14,15 yaparak, dünya çapında yükselmeye devam ediyor. Harici bir diyaliz makinesi böbrekler bu rolü gerçekleştirmek mümkün değilse metabolik atıkların bir hastanın kanını kurtulmak için hizmet sayede örneğin hemodiyaliz gibi tedaviler mevcuttur. Ne yazık kiTedavisi devam eden yaşam için gerekli olduğu, bu müdahale, sınırlamaları vardır. Ayrıca, hastalar en sonunda hasta, bekleme üzerine yerleştirildiği zaman almak için yıllar alabilir bir böbrek nakli gerektirecektir. Hatta bir böbrek nakli aldıktan sonra, birçok hasta prosedürü sonucunda olumsuz etkileri acı ve hayatlarının geri kalanı için bu etkileri savaşmak zorundadır. Bu zorluklar, böbrek hastalığı önlemeye ya da belki de, doku rejenerasyonu 8,16,52,53 ek olarak bir yardımcı olmak için ya da yeni tedavilerin geliştirilmesi için ciddi bir ihtiyaç göstermektedir. Biyomedikal laboratuarlarda insan deneğin kullanımının bariz etik kısıtlamaları göz önüne alındığında, hayvan modeller, insan hastalığının patogenezinde çalışma için yeni tedavilerin testleri için gereklidir. Anatomik benzerlik ve evrimsel yakın bir sonucu olarak, fare, insan hastalıklarının 45 en yaygın olarak kullanılan model olmuştur. Ancak, bu hayvanın belirli sınırlamalar dahil olmak üzere, vardıryetersizlik ing in vivo ve büyük ölçekli genetik ekranlar tamamladıktan pratiklik organ gelişimini görselleştirmek için. Zebra balığı insan hastalığı 45,46 organ gelişimi ve modelleme çalışmaları için uygun bir ve faydalı model organizma vardır. Insan hastalığı ile ilgili olarak, zebrabalıkları fonksiyonel homologları ve insan genlerinin tüm 54,55 yaklaşık% 70 mevcuttur. Son çalışmalar böbrek araştırmalar 31,37,56 birçok alanları için zebrafish programını ortaya koymuştur. AKI sonra Zebrafish yenilenme ve onarım çalışmaları tübül epitel rejenerasyon ve neonephrogenesis oluşur ve 30,37 Timecourse rejenerasyon boyunca üst üste iki süreç olduğunu göstermektedir. Bir aminoglikozid antibiyotik olarak adlandırılan gentamisin kullanımı yetişkin zebrabalıkları 29,30,37 ABH sonuçlarını incelemek için aracılığıyla bir yaralanma paradigması olarak kullanılmıştır. Gentamisin bir yaklaşık olarak iki haftalık bir süre boyunca yaralanmayı takip eden, proksimal tubules yeniden, ve bu arada yeni nefron organı 29,30,37 boyunca oluştururlar. Genel olarak, epitel rejenerasyon düzenleyen mekanizmalar son derece tartışmalı kalır. Tamir işleminin bir önerilen mekanizmasında, lümenine ölü hücre dökülmesi ve ardından başlangıç ​​akut yaralanma olay vardır. Sonra, yeni hücreler ayırt sonra de-farklılaşma, çoğalma ve göç olayları bir dizi, yaralı bazal membran repopulating ve yaralı siteye işlevini geri vardır. Alternatif olarak, diğer çalışmalar yedek hücreler nefron tübüller içinde ikamet kök / progenitör hücrelerden kaynaklanan ileri sürmüşlerdir. Zebrabalıkları neonephrogenesis süreci ile ilgili olarak, hücre agregatları gentamisin enjeksiyon 29,30 tarafından aşağıdaki AKI gözlenmiştir. Bu agregalar sonra zaten mevcut olan tübüllerine 29,30 içine indiğimizde yeni nefron içine olgun. Nefron epitel rejenerasyonu ve neonephr birleştiren ortak konuogenesis onların sırf gizem faktörü: Şu anda bu rejeneratif kahramanlık geçerli anlayışlar vardır daha ortaya nasıl hakkında katlanarak daha sorular vardır. Ancak bugüne kadar, kanıt birkaç heyecan verici çizgileri zebrafish kullanarak böbrek yenilenmesi araştırması gerçekten de doğrudan öteleme potansiyel 56-58 olabilir insan AKI içine ilgili karşılaştırmalı bilgiler sağlayabilir olduğu fikrini desteklemektedir. Kimyasal tarama son histon deasetilaz inhibitörü metil-4-(feniltio) -butanoat (m4PTB) 56,57 tanımlanmasına yol açan zebrafish embriyo böbrek projenitör hücrelerin çoğalmasını arttırmak küçük molekülleri tanımlamak için. Gentamisin kaynaklı AKI ile zebra balığı larvalarına karşı Bu bileşimin uygulanmasıyla larva yaşama ve artmış renal tübüler çoğalması 56,58 gelişmiş olduğunu göstermektedir. Orta işemi ile uyarılan AKI ile farenin m4PTB ile muamele edildi, geri kazanımlarının Assoc hızlandırıldırenal tübüler hücrelerin 58 çoğalan hem tübüler atrofi ve hücre döngüsü tutuklama bir azalma ile iation. Bu bulgular, normal zebra balığı böbrek gelişimi ve / veya AKI rejeneratif tepki sorumlu yollar memelilerin 56 ile konserve olacağını göstermektedir. Böylece, ileri çalışmalar söz konusu sinyalizasyon yolları belirlemek ve bunların etkileşimleri-zebrabalıkları nefroloji alanında bu önemli hedef için bir umut cadde sağlar anlamak rejenerasyon-yani mekanizmalarını ayrı kızdırmak için gerekli iken. Bunlar da bu protokolde tarif nefron hücre etiket gibi araçlar, AKI modellerinde böbrek kompozisyon ve özelliğe değerlendirmek için kullanılabilir tahlillerin bir grubunu temsil eder. Dahası, böbrek hastalığı transjenik modelleri karakterize uygulanabilir ve böbrek baraj sonra nefron yapının restorasyon teşvik edebilen kimyasal terapötik durumların belirlenmesinin yol sağlayabiliryaş.

Böbrek vücutta fizyolojik fonksiyonları yerine getiren bir çok kompleks bir organdır. Böbreğin en önemli işlevi, metabolik atık atılımı olduğunu ve bu görevi yakından sıvı dengesinin korunması ile iç içedir. Böbrek eş zamanlı kan basıncı, elektrolit düzeyleri ve asit-baz dengesini düzenleyen ederken, kan filtreleme ve idrar oluşturarak bu işleri gerçekleştirir. Nefron denilen çok özel epitel tübülleri böbrek 1,2 temel fonksiyonel birim olarak hizmet vermektedir. Yetişkin omurgalılarda, nefron genellikle birçok tübülleri oldukça küçük organ haline paketi dolayısıyla izin veren bir merkezi drenaj sistemini çevreleyen sıkıca sarılmış bir düzende organize edilmektedir. Örneğin, her bir insan böbrek üstü 1.000.000 nefron 3 içerebilir. Fare gibi diğer memeliler böbrek başına 4 8-10 bin nefron sırasına sahip. Böbrek karmaşıklık derecesi, bu memeliler ve diğer vert arasındaki farklılıktoplam nefron sayısında varyasyonlar ve böbrek içindeki mimari düzeni nedeniyle ebrates. Pronephros, mezonefrostan ve metanephros: Omurgalı türlerin çok üç ardışık gelişim sırasında böbrek yapıları ve nefron bağış ve düzenleme ile ilgili artan karmaşıklık her bir form görüntüler oluştururlar. Muhafaza edilmesi son böbrek yapısı yetişkin böbreğinin organ tipik olarak bir ya da mesonephros metanephros 2 olarak hizmet vermektedir. Her bir böbrek şekilde, ancak, nefron bazlı kompozisyon 2&#39;ye sahiptir. Nefron böbrek beygir ve metaboliti salgısı ve reabsorption birlikte kan filtrasyon sorumludur. Nefron epitel hücrelerden oluşan basit tübüler yapılardır ve farklılaşmış epitellerinden ayrık, son derece uzmanlaşmış alanları belirli görevleri yerine hangi segmental bir örgüt daha var. Nefron boyunca süzülen madde akış için, tipik haliyle, üç büyük parçaları Compris ki oradaE her birim: (1) renal korpuskül, proksimal, orta ve distal segmentleri ile (2) bir borucuk, ve (3) bir toplama kanalı 1. Proksimal tübül organik çözücüler, özellikle glükoz ve amino asitlerin 1 geri emiliminin sorumludur. Ara tübül (veya Henle loop) tuz ve su Kural 1 önemli bir sitedir. Son olarak, tuz ve diğer iyonlarının ince ayar tübül içinde ve uzak toplama kanalında ortaya çıkar ve son derece endokrin sistemi 1 tarafından düzenlenir. Oradan, süzüntü sonuçta bir atık ürün 1 olarak vücuttan çıkan, üreter ve mesane üzerinden geçecek. Böbrek fonksiyon kaybı, normal nefron etkinliği önlemek nedenleri çok sayıda kaynaklanıyor olabilir. Bu nedenler böbrek gelişimi, örneğin, yaralanma farklı türde nefron 5 veya nedenleri sakat doğumlara yol konjenital defektler (genetik ve environme hem kaynaklanan sırasında oluşabilirntal kökenleri). Edinsel yaralanmalar geniş akut böbrek hasarı (ABH) veya kronik böbrek hasarı (KBH) olarak kategorize edilir. AKI genellikle iskemi veya toksin maruziyeti 6,7 kaynaklanan böbrek fonksiyonlarında ani bir kaybı içermektedir. Memelilerde, nefron epitel onarım tür yaralanmalarda 8 sonra mümkün olduğunu ve birçok kişi AKI sonra böbrek fonksiyonlarında tam restorasyon sergilerler. % 70 insidans aralığında 6,7 - Ancak, AKI geniş bir 30 arasında rapor edilmiştir, yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. CKD, aksine, tipik olarak 8,9 fibroz ile bağlantılı uzun süreli hasar yıl kaynaklanan böbrek fonksiyon kaybı ile ilişkilidir. Ya bir diğer 10-12 bireyin yatkınlık gibi ayrıca bir etkileşimi, AKI ve KBH arasında var. Örneğin, AKI muzdarip olanlar CKD ve hatta ölüme 13 daha duyarlıdırlar. Böbrek hastalığı görülme sıklığı, ABD&#39;de hem de dünya genelinde, epide ulaşmıştırmikrofon oranlarda ve yaşlı nüfus böbrek 14,15 için rejeneratif tıp müdahaleleri tanımlamak için artan bir ihtiyaç vardır-bu nedenle genişledikçe artacağı tahmin edilmektedir. AKI hasta kurtarabilirsiniz bu bilgiye rağmen, uzun böbrek doğuştan rejeneratif güçlerine olmayan bir organ olduğu düşünülmektedir. Bu geleneksel görünümünü büyük ölçüde son yıllarda 16 olarak revize edilmiştir. AKI sonra farelerde ve sıçanlarda böbrek hasarı araştıran bir çalışma nefron tübül epitel hücrelerinin çoğalmasını ve fonksiyonel nefron 17-20 yeniden göstermiştir. Memeliler nefron yenilemek için bu adaptif bir yeteneğe sahip olmasına rağmen, böbrek fibrozis ve KBH 21 yol tetiklenebilir önemli sınırlamalar ve uyumsuz tepkiler vardır. Örneğin, yeni bir çalışma kemirgen nefron tekrarlanan epitel hücre ablasyon azalmış rejenerasyon ve hav böbrek fibroz-düşündüren nefron ile ilişkili olduğunu göstermiştiradet rejenerasyon eşik 22 sınırlıdır. Yetişkin memeli böbrek, kayıp ya da hasarlı olanları yerine yeni nefron oluşturan dolayısıyla imha kalıcı bir nefron açığı 8,9 yol açtığına dair kanıt yoktur. İlginçtir, bazı omurgalılar nefron epitelyaya yenileyici tarafından ve aynı zamanda yeni nefron üreterek AKI cevap yok, bir süreç neonephrogenesis veya nefron neojenezi 23 olarak anılacaktır. Neonephrogenesis toksin maruziyeti veya kısmi rezeksiyon sonrası balık oluşur ve yaralanma modelleri tarihsel olarak daha yakın akvaryum balığı 24,25, tilapia 26, paten 27, Medaka&#39;nın 28, ve, Zebra balığı 29,30 dahil ettik. Bunlardan, Zebra balığı böbrek rejenerasyon sorumlu hücresel ve moleküler yollar keşfetmek için uygun bir genetik araştırma modeli sağlar. Bu video makalede, biz yetişkin zebrabalıkları nefron segmentleri etiketlemek nasıl gösterilmektedir. Nefron anatomi, moleküler özellikleri Bilgi,ve fonksiyonel özellikleri zebrafish kullanarak başarılı bir gelecek böbrek çalışmalar için gereklidir. Yetişkin zebrabalıkları böbrek mezonefron yapıdır ve yetişkin memelilerin, kuşlar, sürüngenler 31 bulunan metanephros yapıdan daha nefron sayısında ve organizasyon açısından doğası gereği daha az karmaşıktır. Bununla birlikte, zebra balığı nefron kademeli bir kurum memelilere benzerdir ve birinci gen ekspresyon çalışmaları 31-35 göre embriyonik böbrek belgelenmiştir. Zebra balığı embriyo nefron proksimal kıvrık tübül (PCT) dahil lineer borucuk kesimleri, proksimal düz tübül (PST), distal erken (DE), ve distal geç (DL) 31-35 (Şekil 1) içerir. Zebra balığı yetişkin nefron benzer tüp şeklindeki segmentleri 30,31,36,37 (Şekil 1) sahip. PCT ayrıca fonksiyonel bir fenotip ile tanımlanabilir: PCT epitel hücreleri içinde mevcut floresan etiketli dekstran bileşikleri (boyut olarak 10-70 kDa) bir araya getirecekembriyonik böbrek ve yetişkin zebrabalıkları iki kullanılmıştır dolaşımı, bu proksimal tübül hücreleri 38-41 (Şekil 1) endositik alımını değerlendirmek. Zebra balığı ve memeliler arasında nefron segmentlerinden biri fark Zebra balığı bir ara tubule veya Henle 30-37 döngü yoksun olduğunu; Memelilerde bu segment fonksiyonları su tasarrufu için, ve zebra balığı kendi idrarı konsantre bir aciliyet olmadan bir tatlı su türü olduğundan, bu zebra balığı Bu segmenti 32,33 yoksun olması şaşırtıcı değildir. Bu nedenle, genel olarak, büyük ölçüde bileşimin nefron zebrabalıkları ve memeli böbrek 32,33 arasında muhafaza edilir. Bu benzerlikler gelişimsel nefrogenezisi 32-35,42 sırasında renal ifade edilen genlerin fonksiyonlarını incelemek ve bu şekilde olabilir, insan koşullarının önemli listesine ilave sayısız böbrek hastalıkları 43,44 modellemek için kullanılan bir araştırma aracı olarak zebrafish sağlamıştır kullanılarak incelenmiştirZebra balığı 45,46. Bugün, yetişkin zebrabalıkları böbrek nedeniyle genetik tractability ve bu türün gen fonksiyonu ve sinyal yolları sorgulamak için kullanılabilir teknolojik kaynakların genişleyen damak böbrek rejenerasyon karşılaştırmalı çalışmalar için cazip bir modeldir. Çeşitli çalışmalar AKI 29,30,37 sonra rejenerasyon mekanizmalarının araştırılması için Zebrafish mesonephrosun kullandık. Yetişkin zebrabalıkları böbrek kullanmaya devam AKI araştırma için, nefron işlevselliği ankete farklı nefron bölgeleri ve yöntemleri etiketlemek zarif yöntemler olması esastır. Yetişkin böbrek analizi için çeşitli yöntemler embriyonik böbrek protokollerden adapte edilmiştir. Yetişkin Zebrafish floresan işaretli dekstran enjekte edilmesi, zebra balığı embriyolarının 38-41 (Şekil 1) deki gibi, endositoz yoluyla 30 mezonefron nefron olarak PCT epitel etiketler. Bu yöntem, visualiz için kullanılmıştırproksimal tübüller restore fizyolojik fonksiyonu 30 (Şekil 1) bir değerlendirilmesini sağlar AKI, sonrasında kendi reabsorbing mülkünü geri e. Nefron proksimal tübül bir başka özelliği, bu alandaki epitel hücreleri, endojen alkalin fosfataz faaliyetinin yüksek seviyelerini gösteren bir fırça sınır 37 sahip olmasıdır. Bu nedenle, yakın epitel cin çarpmış (Enzimle İşaretlenmiş Floresans) olarak bilinen bir floresan-dayalı bir teknik kullanılarak 47 -97 yetişkin zebrabalıkları böbrekte görsel olarak tespit edilebilir. Burada, biz proksimal tübül fonksiyonel değerlendirmesini almak ve bu tübül segment boyutu ve konturları harita şekilde, yetişkin zebrabalıkları böbrekte floresan dekstran alımı tayinidir 30,48 gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Sonra, fluoresan bir etiket alkalin fosfataz ile erişkin nefron proksimal tübül bölgelerini etiketlemek için teknikleri açıklar. Üçüncü olarak, ilk kez rhod gösterecekamin-etiketli lektin Dolichos memeli böbrek 49 toplama kanalları genel bir işaretleyici olarak kullanılmaktadır aglutinini (DBA), biflorus, yetişkin zebrabalıkları böbrek uzak tübül işaretler. DBA alkalin fosfataz boyama dışlayan olduğu gibi, bu etiketler geniş yetişkin zebrabalıkları nefronun pan-uzak menziller karşı pan-proksimal ayırt etmek için bir yol sağlar. Bütün montaj ve Kriyostaz histolojik bölümlerde hem de bu floresan lekeleri uygulanması boyunca, benzersiz her nefron segmenti tespit çözünen taşıyıcı genlerin ekspresyon alanları ile bu etiketleri ilişkilidir. Bu nedenle bu protokol de bizim embriyo DİLERİZ protokol 50 dayanan in situ hibridizasyon (DİLERİZ) analizlerinde yetişkin doku bütün montaj için modifiye doku işleme prosedürleri için bir rehber içerir. Bu prosedürler, O morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini belge çeşitli kombinasyonlarda (Şekil 2) kullanılabilirf yetişkin zebrabalıkları böbrek nefron. Böylece, bu protokol yenileme çalışmaları, diğer renal hastalık modelleri içinde fenotipik karakterizasyonu uygulanabilir ve hatta yetişkin böbreğinin oluşumunu çalışmak için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Made by diluting 10 X PBS in distilled water.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS with 0.05 % Tween</td><td></td><td></td><td>0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&amp;deg;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Other modeling clays can be substituted and work similarly</td></tr><tr><td>Slide holder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Optional: cardboard tray to store slides flat</td></tr><tr><td>Bleaching solution</td><td></td><td></td><td>Bleach mix formula (for a 20 ml solution):&lt;br/&gt; 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution&lt;br/&gt; 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution&lt;br/&gt; 100 &amp;mu;l of 20% Tween&lt;br/&gt; Fill to 20 ml with distilled water</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Solution (for a 10 ml solution):&lt;br/&gt; 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween&lt;br/&gt; 2 ml of fetal calf serum&lt;br/&gt; 150 &amp;mu;l of DMSO</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase activity detection</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&amp;nbsp; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#039;s instructions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase wash solution</td><td></td><td></td><td>Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):&lt;br/&gt; 5 ml of 0.5 M EDTA&lt;br/&gt; 120 mg of Levamisole&lt;br/&gt; 95 ml of 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Staining Solution (for a 100 &amp;mu;l solution):&lt;br/&gt; 1 &amp;mu;l of DBA&lt;br/&gt; 99 &amp;mu;l of 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 adhesive microscope slides</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker &amp;ndash; super PAP pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&amp;trade; HM 525 Cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Zebra balığı modeli böbrek geliştirme, yenilenme ve hastalığı incelemek için ilgili sistem olarak ortaya çıkmıştır. Hem embriyonik ve yetişkin zebrabalıkları böbrekler yüksek omurgalıların memeliler dahil olmak üzere diğer ile muhafaza edilmektedir nefron olarak bilinen bir işlevsel birimler oluşmaktadır. Zebra balığı Araştırma zamanlarda yetişkin nefron hasar meydana sonra iki farklı fenomen sızmak olduğunu göstermiştir: Birincisi, tahrip tübül epitel hücreleri yerine mevcut nefron içinde sağlam yenilenmesi vardır; ikinci olarak, tamamen yeni nefron neonephrogenesis olarak bilinen bir süreç böbrek öncü hücrelerden üretilmektedir. Bunun aksine, insan ve diğer memeliler nefron epitelyal rejenerasyon için sadece sınırlı bir yeteneği var gibi görünmektedir. Bugüne kadar, bu böbrek rejenerasyon olayların sorumlu mekanizmalar anladım kötü kalır. Yetişkin zebrabalıkları böbrekler hem nefron epitel rejenerasyonu ve neonephrogenesis uğradığından, onlar olağanüstü bir deneysel bıraktı sağlamakBu olayları incelemek digm. Ayrıca, böbrek rejenerasyon düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için kullanılabilir Zebra balığı modelinde mevcut genetik ve farmakolojik araçlar geniş bir yelpazesi var. Bu tür bir araştırma önemli yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirilmesidir. Bu protokol, yetişkin zebrabalıkları böbrek, böbrek ve test bileşimi nefron özelliğe ölçmek için kullanılabilir etiketleme teknikleri yer verilmiştir. Bu durumda, bu yöntemler arasında, ancak bunlarla kısıtlı değildir yetişkin zebrabalıkları böbrek yetmezliği paradigmaların, nephrotoxicant maruz rejimler veya nitroredüktaz aracılı hücre ablasyon tekniği olarak hedef hücre ölümü genetik yöntemler ileride fenotipik nitelendirilmesi için geniş çapta uygulanabilir. Dahası, bu yöntemler, yetişkin böbrek oluşumunda genetik pertübasyonları incelemek için kullanılabilir ve aynı zamanda kronik hastalık modelleme boyunca renal durumunu değerlendirmek için uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

43.9K Görüntüleme.  University of Notre Dame.  Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır. 

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Biyoloji

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Yetişkin Zebra Balıklarında Cisplatin tarafından İndüklenen Akut Böbrek Yaralanması Modeli

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Tıp

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Depigmentation and Prestaining of Zebrafish Kidney: A Technique to Prepare Adult Zebrafish Kidney for Staining

Source: McCampbell, K. K. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/51644" target="_blank">Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2014)
In this video, we demonstrate the depigmentation of adult zebrafish kidney and its subsequent preparation for staining procedures. Post-staining, the adult zebrafish kidney can be used for studying kidney regeneration, phenotypic characterization of renal disease models, and nephron functionality.