Bu çalışma Dr Ungrin için yeni bir araştırmacı start-up hibe altında, Calgary Üniversitesi tarafından finanse edildi.

NOT: Microwell plakaları istenen sonuçlara bağlı olarak farklı formatlarda mevcuttur. Özellikleri yanı sıra her bir biçimi kullanılmalıdır hücrelerin minimum ve maksimum sayısı için yaklaşık kurallar Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. Daha küçük olan mikro-keskin bir noktaya konik ve küresel cisimler arasında değişkenlik daha küçük boyutlarda daha önemli hale gelir, ancak bu şekilde bir alt boyut sınırı vardır. Az 20, hücrelerin her biri için ortalama küremsi rutin üretimi basit 8&#39;dir. Daha büyük boyutlu mikro tam konik değildir, bu nedenle her bir kuyucuğa birden fazla daha küçük küremsi neden olabilir küçük hücre numaraları parçacıklarının oluşturulması için çalışır. AggreWell 400Ex plakaları kullanılıyorsa yüzey özellikleri nedeniyle bir miktar farklardan ötürü, sürfaktan çözeltisinin (adım 1.2) ile hazırlanması isteğe bağlı değildir. Bu protokol AggreWell 400 plakalarının kullanılması dayanmaktadır - başka biçimleri için aleyhteUlt Tablo 1. Her çukurdaki yüklenecek hücre sayısı her sfero için kümelenmiş hücrelerin sayısına göre içeren mikro oyuk sayısı çarpılarak belirlenir. Örneğin, her biri 1000 hücrelerinden sferoidler elde etmek için, her bir (1,200 kez küremsiler 1.000 hücreler her biri =) 1.2 x 10 6 hücre ile yüklenmiş olması gerekir. Hücre yoğunluğu, hücreler 0.4 ml &#39;lik bir hacim içinde yüklenir verilen hesaplanmalıdır. Bu nedenle, her 1000 hücre oluşan küremsiler, örneğin 0.4 ml 1.2 x 10 6 hücre ml için 3 x 10 6 hücre yoğunluğunda çevirir. 1.. Hücreleri Alma hazırlanıyor Mikrodelikler <ol><li> Mikro plakalar sağlanan steril, ve sadece bu tür bir laminar akışlı biyo-güvenlik kabini olarak steril bir ortamda da ambalaj çıkarılmalıdır. Sterilite protokol boyunca muhafaza edilmelidir. Kısırlık oyuklar kullanılarak su içerisinde% 70 etanol kullanılarak sterilize edilir, tehlikeye olmalıİsteğe bağlı adımları izleyerek. <ol><li> Her kuyu için, kullanılmayan% 70 etanol, 0.5 ml ilave edilir. Bazı mikro-yakalanacak hava kabarcıkları, bu bir yandan bir sıvı ekleyerek ve daha çok yüzey üzerine dikey olarak bırakarak daha yüzeye yayılmış izin azaltılabilir, ancak. Kapağı değiştirin. </li><li> Etanol buharı hızlı bir şekilde herhangi kabarcıklarını nüfuz gerekir iken çok sayıda varsa, bunları kaldırmak için istenebilir. 2,000 x g, 2 dakika boyunca santrifüj. Bu rotor doğru bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> Oda sıcaklığında on kapak ile 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Aspire etanol. Plaka hemen hemen kullanım için steril su ya da PBS ile yıkanmış ya da depolama için hava ile kurutulabilir. </li></ol></li><li> Hücreler mikro yüzeyi ile etkileşmeyen sağlamak amacıyla, bir yüzey aktif madde kullanılarak hazırlanabilir. Genel olarak, birsonra başlangıçta bu adımı gerçekleştirmek için tavsiye ve ve yüzey-kaplanmış mikro olmaksızın üretilen sferoitleri karşılaştırın. <ol><li> Her bir oyuğa Çalkalama solüsyonu, 0.5 ml ilave edilir. Bazı mikro-yakalanacak hava kabarcıkları, bu bir yandan bir sıvı ekleyerek ve daha çok yüzey üzerine dikey olarak bırakarak daha yüzeye yayılmış izin azaltılabilir, ancak. Kapağı değiştirin. </li><li> Kabarcıklarını çıkarmak için 2000 x g&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu rotor doğru bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> Oda sıcaklığında kapağın üzerinde en azından otuz dakika süreyle inkübe edilir, ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de Uygun bir şekilde kurumasını engellemek üzere sızdırmaz eğer gerekli olana kadar plakalar kuyularda yüzey aktif madde çözeltisi ile dört derecede muhafaza edilebilir. </li><li> , Steril su ya da kullanmak için hemen önce PBS ile plakayı yıkayın. Plakalar izin vermeyinkaplamadan sonra kurumaya. </li></ol></li></ol> 2. Hücreleri hazırlanıyor NOT: Hücre hazırlanması ile ilgili bilgiler belirli bir hücre tipi çalışılmaktadır ile biraz değişecektir. Ancak, burada tartışılan hatları, hem insan ve fare embriyonik kök hücreleri (ESC), insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC), fibroblastlar, varsayılan ilk endoderm da dahil olmak üzere hücreleri, geniş bir yelpazesi ile birlikte etkili olması için, bu koşullar gözlemledik ve stromal hücreler. Diğer gruplar mezenkimal kök hücrelerin 9 kondrogenezisi dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi için başarıyla bu sistemi istihdam var, pluripotent kök hücreleri 10 nöral öncülerinin standardize nesil, toksikolojik hepatositler 11 ve semenderler 12 omurilik yenilenme değerlendirme analizleri. HT29 hücreleri ile çalışmak için özel protokol burada gösterilir. <ol><li> DMEM HT29 hücrelerinin bir T75 şişesi, başla+% 10 FBS </li><li> Aspire büyüme ortamı şişeden, tripsin ve 3 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe hücreleri </li><li> Büyüme ortamının 3 ml eklenerek tripsin sindirim durdurun. Hücre sayımı için bir numuneyi çıkarın ve bir 15 ml santrifüj tüpüne kalan aktarın. </li><li> 200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Santrifüj devam ederken, hücreleri saymak. </li><li> Aspire tripsin / orta karışımı, yukarıda hesaplanan istenen hücre yoğunluğuna göre belirlenir taze büyüme ortamı hacmi ile değiştirin. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) herhangi bir yığınının ortadan kaldırmak için bir süzgeç vasıtasıyla hücre süspansiyonu geçirin. NOT: Hücre toplama koşulları çizgiler arasındaki biraz değişecektir. , Örneğin, ilgi konusu hücreleri pasaj yapmak için uygun bir ayrışma protokol kullanılabilir, bu bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılmalıdır. Tripsin hassas hücre çizgileri kullanımı ile aşırı hücre ölümüne neden olabilir. Bu durumlarda biz alternatif bir dissociati olarak TrypLE kullanarak iyi sonuçlar gözlemledikreaktifi 8. Hücreler ayrışma sırasında topaklaşan olmak ve canlılığı kaybederseniz, enzim çözeltisine DNAaz eklenmesi bu sorunu çözmek olabilir. Ayrışma sürelerini azaltarak ve hücre kümeleri kırmak için bir trituration adımı kullanarak da canlılığı artırabilir. </li></ol> 3. Sfero Oluşumu Not: sferoitler hususiyetlerini ancak ilk denemeler hücreler ortam bileşiminin değiştirilmesi sonuçları bir 3-boyutlu bir kültür sistemine geçiş sonuçlarını ayırt etmek için, kültüre edildiği bir ortam kullanılarak gerçekleştirilebilir olmalıdır, orta formülasyonlar çeşitli oluşturulabilir. <ol><li> Her bir oyuğa büyüme ortamı, 0.4 ml ilave edilir. </li><li> Kabarcıklarını çıkarmak için 2000 x g&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu rotor önce uygun bir santrifüj için bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> 0.4 ml ekleyin(yukarıda hesaplanan) istenilen yoğunlukta hücre süspansiyonu. Yavaşça mikro oyuk içine hava kabarcıkları tanıtan olmadan, aşağı yukarı pipetleme karıştırın. Bu hücreler, düz bir şekilde tutarlı sferoidler elde etmek amacıyla, kuyunun boyunca dağılmasını sağlamak için önemlidir. </li><li> 200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. Plaka santrifüj sırasında kendini düzeyde değilse, konveksiyon akımları mikro oyuk genelinde hücrelerin düzensiz dağılımı bu sonucu ortaya çıkabilir. Ağırlık plaka taşıyıcının her iki tarafında eşit olarak dağıtılmış olduğu nedenle, levha, diğer levha karşı hem de dahili dengeli olmalıdır. </li></ol> NOT: düzensiz hücre dağılımı kanıt görülür ise, levha taşıyıcı üzerinde pivot noktaları için yağlama az miktarda uygulamak gerekli olabilir - yönergeler için santrifüj üreticisine başvurun. Not: hücreler, mikro oyuk içine santrifüj edildikten sonra, bunlar oldukça dirençli olanplakanın küçük hareketlerinden yıkama dışarı tant. Orta sloshing neden ani hareketler kaçınılmalıdır, ancak mikroskop santrifüj plaka veya kuvöz transferi önemli hücre değiştirmesine neden olmamalıdır. <ol start="6"><li> Bir ters mikroskop kullanılarak, hücreler, mikro oyuk içinde toplanmıştır ve dengeli bir şekilde dağılmış kuyu olduğunu doğrulamak. </li><li> 37 ° C de bir gece inkübe </li><li> Bir ters mikroskop kullanılarak, küremsi oluşum sürecini gözlemlemek. Bazı hücre hatları diğerleri daha uzun sürebilir, 24 saat içinde kompakt sferoitleri oluşturacaktır. HT29 hücreleri toplamak için kümeden ilerleme, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Mikro oyuk gelen küremsilerin kurtarmak ve yavaşça bir pipetle onları jeti tarafından süspansiyon kültürü aktarmak. Seçenek olarak ise, ortam değiştirme 8 ile yerinde muhafaza sferoidler - süresi başlangıç ​​boyutu ve büyüme oranına bağlıdır, burada defOnlar meydana edildiği Mikrodelikler büyümek kadar zaman ine. <ol><li> Pasteur pipet kullanarak iyi kenarında sferoidler, aspirat orta kaybetmeden orta değiştirmek için. Yavaş yavaş menisküs sıvıyı çekmek için başlayana kadar aşağıya ucu getirmek, ve düşer gibi menisküs aşağı izleyin. Daha sonra aynı yerde iyi duvara taze ortam ilave edin. Birkaç küreler, ortam aspire edilmiş ve her zaman aynı pozisyonda değiştirilir, ancak, bu sayı tüpün içindeki çok sayıda karşılaştırıldığında küçük kalır, kaybolabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr Ungrin bir mucit olarak AggreWell teknolojisinde bir mali çıkarı var.

Bu düzgün küremsi çok sayıda farklı kaynaklardan birden fazla hücre çizgilerinden elde edilebilir, böylece bir sistem kurduk. Biz, bu koşullar altında küremsilerin birlikte bir yapışkan hücre hattı karşılaşmaya henüz. Biz daha önce ancak bugüne kadar bu sorunu tümör hatları ile ortaya çıkmadı, anoikis 5,8 eğilimli popülasyonunda hücre kaybını gözlemledik. Sistem, 24-kuyu ve 6-çukurlu formatta, hem de şu anda geliştirilmekte olan mikro-50000 içeren her prototip biyoreaktörlerde mikro oyuk tutarlı davranışı ile, bir yüzey alanına sahip isteğe bağlı olarak ölçeklenebilir. Asimetri bir endişe olabilir Sferoid olmalıdır, adım 4.8 &#39;de inkübasyon süresi iki ya da üç gün artabilir. Sferoitler hususiyetlerini aynı zamanda, ancak bu durumda başka bir bakım wi temas küremsi gibi, yeterince düşük bir kültür yoğunlukları tutmak için alınması gereken, simetri artırmak için mikro oyuk ekstre sonra bir süre için inkübe edilebilirll genellikle daha büyük yapılar halinde sigorta. Bu nedenle, daha önce bu topaklar birincil sınırlamanın, sfero büyüklüğü olmak üzere, meydana edildiği mikro oyuk içinde kültürleri korumuştur. Bu da büyüme hızı ve başlangıç ​​boyutu 8 hem de bir işlevi olduğunu ve mikro levha içinde uzatılmış kültür planlanan, bu önceden dikkate alınmalıdır. Büyümeyi engellemek için seçenekler, bu meydana gelirse, daha küçük bir küremsi başlayarak veya AggreWell 800 levhanın daha büyük mikro-kullanılarak ya da bulunmaktadır. Spheroids zamanla tutarlılık artmaya başarısız olursa, bir potansiyel nedeni hücre ölümü olabilir. Özellikle yüksek metabolik olarak aktif hücrelerin daha büyük kümeler halinde, oksijen ve temel besin teslim toplu taşıma sınırlamalar bir nekrotik iç kısım 2 neden olabilir - böyle bir yapışkan olmayan küremsi sadece aşırı hücre ölümü bir sonucu olabilir. Alternatif olarak, mekanik YÖK ölçümlerisferoitlerin sion, belirli bir hücre hattı 13&#39;ün metastaz potansiyeli ile ilişkisi, hücreler arası bağlayıcı güçleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu belki de bu tür alan oranına yuvarlaklık ve çevre gibi morfometrik parametreleri kullanarak, sfero şekil ve metastatik potansiyeli arasındaki ilişkiyi araştırmak ilginç olurdu. Küremsiler mekanik ve morfometrik özelliklerini incelemek, ek olarak, mikro sisteminde montaj birden fazla hücre tipleri ve / veya biyomalzeme 6,7 kombinasyonlarından oluşan, karma bileşim küremsi büyük ölçekli üretimine izin verir. Diğer hücre tipleri ile tümör hücrelerinin etkileşimleri bu nedenle, örneğin, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile kombinasyon halinde tümör hücrelerinden sferoidler elde etmek için ilgi çekici olabilir, daha yakından 14 in vivo tümörlerin davranış modeli için önemlidir. Çeşitli biyomalzeme Mikropartiküller da dahil edilebilir ve SPH etkileyebilirdoğrudan hücre 7,15 ve ayrıca küremsi 16 içine büyüme faktörleri ve sitokinlerin kontrollü serbest bırakılması için rezervuar olarak ile etkileşimler yoluyla hem eroid özellikleri. Kısırlık konusunda herhangi bir ilgi vardır Bir önceki deneyin bir parçası olarak, bir kuluçka makinesi içinde bir zaman harcanan bazı oyuklar daha önce kullanılmış olan bir mikro levha ile çalışırken, örneğin oyuklar,% 70 etanol ile sterilize edilebilir su. Küreler, bir kez oluştuktan sonra, aynı zamanda bir hücre süzgecinden fazla süspansiyon geçirilmesiyle kalıntı adi hücrelerden ayrılabilir. Sferoidler muhafaza olacak ise tek tek hücreler, geçecek. Küremsi kültür boyunca, potansiyel olarak metastatik hücrelerin dökülme şüphesi varsa, bu işlem birkaç defa gerçekleştirmek istenebilecektir - ilk adi hücreleri çıkarmak için, ve daha sonra saflaştırıldı ve izole etmek içinHücrelerin d popülasyonları sferoitler tarafından verilen.

Tümör hücreleri daha fizyolojik ilgili sistem 1 için geçiş yaparken, geleneksel doku kültürü platformlarda belirlenen terapötik ajanlar etkinliğini kaybedebilir onlar zaman plastik kültüre yapmak daha üç boyutlu kültürlerde farklı davranırlar, delil artan bir vücudu var. Hem kendi temel biyoloji içgörü kazanmak için, bu şartlar altında kanser hücrelerinin davranışlarını incelemek için, ve aynı zamanda kliniğe tarama tesis yeni terapötik ajanlar geçme başarı oranını artırmak için istenmektedir. Uzun bir geçmişi olan biri, faydalı model sistemi tümörü küremsilerden 1,2 olarak bilinen kanser hücrelerinin üç boyutlu kümeler kullanır. İdeal olarak, küremsi oluşturulması için teknikler boyut ve bileşim deneyi tarafından kontrol edilir düzgün küremsi sayıda üretimini izin verebilir. Asılı bırak ve iyi plaka yaklaşır 3,4 bu yeniden bazı yerine getirmek mümküngerekliliklerine göre, verim genellikle sınırlıdır ve parçacıklarının çok sayıda nesil bir emek-yoğun bir görev haline gelir. Biz son zamanlarda rejeneratif tıp alanında 5 benzer zorlukları çözmek için bir sistem geliştirdik. (Bkz. Şekil 1) yoğun bir şekilde mikron çaplı bir dizi kuyucuk içinde zorunlu toplanmasını istihdam, bu yaklaşım, çok sayıda hücre türleri 6 karışımları yanı sıra çeşitli biyomalzeme 7&#39;nin dahil edilmesi de dahil olmak üzere hücre rasgele sayı, ikinci küremsiler üretilmesini sağlar. Bin ya da daha fazla yüz binlerce - - Küresel şekiller, çok sayıda teşkil edilir ve hemen özü ya da iki (yayınlanmamış gözlem) haftaya kadar en az bir 8 için ortam değişikliği ile oluşturulan edildiği mikro oyuk olarak muhafaza edilebilir. Bu sistem, bu nedenle de effe değerlendirilmesi için çok sayıda üniform ve tekrar tümör küremsiler üretimi için uygunduryeni anti-tümör maddeleri ya da temel biyolojik araştırmaların ctiveness.

<table><tbody><tr><td>AggreWell 400 plate</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27845/27945</td><td></td></tr><tr><td>Rinsing Solution</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (37 &lt;span id=&quot;docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604&quot; style=&quot;font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;&amp;micro;m&lt;/span&gt;)</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-676</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene (EDTA)</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-660</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12002-212</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA-95042-112</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>VWR / Motic</td><td>CA19000-610</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td><td>VWR / Beckman</td><td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESBE / Baker</td><td>BKR-SG603AHEUVSP</td><td></td></tr></tbody></table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Tümör sferoidler giderek üç boyutlu olarak tümör hücrelerinin davranışı için önemli bir in vitro modeli olarak kabul edilmektedir. Daha fizyolojik ilgili geleneksel yapışık sayfalık kültürlere göre, onlar daha doğru karmaşıklığını ve gerçek tümörlerde mevcut etkileşimleri özetlemek. Daha iyi tümör biyolojisi, ya da yeni terapötik maddelerin etkinliğini değerlendirmek için, bu model koşum amacıyla, kontrollü bir şekilde ve önemli sayıda, yeniden üretilebilir sferoidler elde edebilmek için gereklidir. AggreWell sistem tek bir hücre süspansiyonu santrifüj edilir içine piramit şeklinde bir mikro oyuk, yüksek yoğunluklu bir dizi oluşur. Hücrelerin sayısı, her kuyucuğa altındaki kümeleme, ve söz konusu farklı hücre tiplerinin sayısı ve oranı deneyi tarafından ortaya süspansiyonun özellikleri üzerinde sadece bağlıdır. Böylece, biz keyfi boyut ve kompozisyon tümör küremsiler üretebilirtemel platform teknolojisini değiştirmek gerek dışarı. Bu da kültür yüzey alanının santimetre karesi başına mikro oyuk yüzlerce son derece yüksek üretim seviyeleri, basit, nonlabor-yoğun bir işlem yoluyla elde edilebilir emin olun. Bu nedenle bu protokol tümör sfero alanındaki araştırmacılara geniş yararlı olacağını bekliyoruz.

Farklılaşan anatomik kökeni bir çok tümör hatları küremsi kolaylıkla üretilir ve süspansiyon kültürü içine ekstrakte edilebilir. 3, her koşul altında son derece düzgün bir küremsi nüfusa bu yöntem ile elde edilebilen tutarlı boyut kontrolü, Şekil göstermektedir. LNCaP prostat kanseri hücrelerinin düzensiz sınırları daha az tutarlı Sferoitlere doğurdu ise davranışlarında net arası hat farklar (mümkünse nedenlerle Tartışma bakın, keskin tanımlı sınırları ile yoğun dolu sferoitleri oluşturan HT29 kolon kanseri hücreleri ve TE6 özofagus kanseri hücreleri ile de görülebilir .) Daha tutarlı bir agrega, en güçlü iç kuvvetleri de bile yine de meydana edildiği mikro oyuk olarak daha simetrik bir biçimde, özellikle de daha büyük boyutta LNCaP agregalar, gözle görülür bir kare piramit geometrisi korumak için ise çökmesine neden Mikrodelikler. Giriş hücresi sayıları ve fizik arasındaki ilişki<html> Elde edilen sferoit olması ile nik boyutlu bir dizi değişkene bağlıdır. Hücre başına hacim ve kullanılan hücre sayısının ürün bazında teorik miktarlar da nedeniyle tek hücre süspansiyonu aşamasında hücre kaybına, hem de aşırı derecede küçük agrega kaybı, hücre kaybı azaltılabilir yetersiz komşularının numaraları ve çekirdek sınırlamalar ve nekroz taşımasından dolayı aşırı büyük agrega. Ebat da toplama işlemi sırasında oluşabilecek herhangi bir proliferasyonu ile etkilenecektir. Bu parametreler hücre hattından hücre hattına değişir gibi, özel fiziksel boyutlara küreler, arzu edilir ise tanıtmak hücre doğru sayıda deneysel olarak tespit edilmelidir. Hücre sayısında bir 8-kat artış küremsi çapı olan bir iki katına ile sonuçlanmalıdır - örneğin, birinci yaklaşım olarak, küremsi çapı dahil hücre sayısının küp kökü ile artması beklenmektedir. <html> &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; _content hep &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Şekil 1. Küremsi üretiminin şematik. Mikro sistemi hücreleri santrifüj edilebilir içine sıkı bir şekilde dolu kare piramit mikro oyuk bir dizi (400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m boyutu için cm2 başına 625) oluşur. Hücreler, eğimli yan duvarlar ile bir araya getirilir ve elde edilen sferoit olması ile boyutu, kullanılan hücre süspansiyonu yoğunluğunu değiştirerek kontrol edilir. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Sferoitler halinde kümelenmiş hücre montajı. Sferoidler yedi yüz HT29 hücrelerinin her birinden meydana gelmiştir. Hemen sonra santrifüj (A), her bir kuyucuğa gevşek hücreler dibinde toplanır. Kümeler muntazam bu durumda alt sağa doğru ofset unutmayın. Bu küme boyutları dizi boyunca tutarlı kalmasını sağladı kabul edilebilir. Önemli küme boyutu farklılıklar diğer dizinin bir tarafında görülür, adım 3.5 Not bakınız. 24 saat (B) için kuluçkalamadan sonra, hücreler arası yapışma güçleri kümeleri daha sonra ekstre edilebilir tutarlı sferoidler, (C) bir araya getirir ve oluşturmak için yol açmıştır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Şekil 3,. Mikro plakalarda oluşturulan küremsi. Küremsi oluşmuş yedi yüz (A, C, E) ya da bin beş yüz (B, D, F) HT29 kolon kanseri hücreleri (A, B), LNCaP prostat kanseri hücrelerinin (C, D) veya TE6 yemek borusu kanseri hücreleri (E, F). Daha yoğun şekilde paketlenmiş HT29 ve TE6 hücreler ile karşılaştırıldığında, özellikle de gevşek bir agrega LNCaP - a preparatı içinde küremsiler tutarlılığını ve aynı zamanda hücre hatları arasında değişimini dikkat edin. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil eder. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Mikrowell biçimi </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Mikrowell genişliği (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Cm2 başına Mikrodelikler </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Oyuk başına mikro- </td><td> 1.200 </td><td> 4.700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Kuyucuktan başına en az hücreleri * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Kuyucuktan başına maksimum hücre * </td><td> 2.000 </td><td> 2.000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Oyuk başına en az hücre * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Oyuk başına maksimum hücre * </td><td> 2.4 x 10 6 </td><td> 9.4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 -% 70 etanol hacmi (mi) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Durulama çözelti hacmi (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - Orta preload hacmi (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3,5 - Cep yükleme hacmi (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> Bu değer, kullanılan spesifik hücrelerin boyutu ile değişecektir ve ampirik olarak belirlenmelidir * olarak kuyucuğa ortalama hücre sayıları sadece bir tahmindir </td></tr></tbody></table> Tablo 1. AggreWell seçenekleri ve protokol modifikasyonlar.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Bu ticari olarak temin edilebilen mikro plakalar kullanılarak, üniform bir boyut ve bileşimin kontrollü tümör küremsi (bin yüz binlerce) büyük sayılar üretmek için bir protokol getirmektedir.

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.4K Görüntüleme.  University of Calgary.  Bu ticari olarak temin edilebilen mikro plakalar kullanılarak, üniform bir boyut ve bileşimin kontrollü tümör küremsi (bin yüz binlerce) büyük sayılar üretmek için bir protokol getirmektedir. 

Video: Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Kanser Araştırmaları

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Genetik olarak tadil edilmiş hücre transplantasyonu için Micropatterned kültür plakalarında Sferoid hücrelere karşı gene

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Biyomühendislik

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various spheroid production methods such as non-adhesive surfaces, spinner flasks, hanging drops, and microwells have been used in studies of cell-to-cell interaction, immune-activation, drug screening, stem cell differentiation, and organoid generation. Among these methods, microwells with a three-dimensional concave geometry have gained the attention of scientists and engineers, given their advantages of uniform-sized spheroid generation and the ease with which the responses of individual spheroids can be monitored. Even though cost-effective methods such as the use of flexible membranes and ice lithography have been proposed, these techniques incur serious drawbacks such as difficulty in controlling the pattern sizes, achievement of high aspect ratios, and production of larger areas of microwells. To overcome these problems, we propose a robust method for fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. This method utilizes a 30 x 30 through-hole array, several hundred micrometer-order steel beads, and magnetic force to fabricate 900 microwells in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. To demonstrate the applicability of our method to cell biological applications, we cultured adipose stem cells for 3 days and successfully produced spheroids using our microwell platform. In addition, we performed a magnetostatic simulation to investigate the mechanism, whereby magnetic force was used to trap the steel beads in the through-holes. We believe that the proposed microwell fabrication method could be applied to many spheroid-based cellular studies such as drug screening, tissue regeneration, stem cell differentiation, and cancer metastasis.

This manuscript introduces a robust method of fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. Using magnetic force, steel beads, and a through-hole array, several hundred microwells were formed in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate.

Eşleştirilmiş boncuk ve mıknatıs dizi Microwells değişken içbükey geometrileri ile kalıplama için

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

Biyokimya

Fabrikasyon ve ardından tümör sferoidlerinin PEG hidrojellerinde 3D kapsüllenmesi

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth. Here, we designed an in vitro 3D glioblastoma model for spheroid encapsulation to mimic the tumor extracellular microenvironment. First, we formed square pyramidal microwell molds using polydimethylsiloxane. These microwell molds were then used to fabricate tumor spheroids with tightly controlled sizes from 50-500 &#956;m. Once spheroids were formed, they were harvested and encapsulated in polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels. PEG hydrogels are a versatile platform for spheroid encapsulation, as hydrogel properties such as stiffness, degradability, and cell adhesiveness can be tuned independently. Here, we used a representative soft (~8 kPa) hydrogel to encapsulate glioblastoma spheroids. Finally, a method to stain and image spheroids was developed to obtain high-quality images via confocal microscopy. Due to the dense spheroid core and relatively sparse periphery, imaging can be difficult, but using a clearing solution and confocal optical sectioning helps alleviate these imaging difficulties. In summary, we show a method to fabricate uniform spheroids, encapsulate them in PEG hydrogels and perform confocal microscopy on the encapsulated spheroids to study spheroid growth and various cell-matrix interactions.

Yazar Spotlight: Glioblastoma Mikroçevre Çalışması için İn Vitro Hidrojel Modeli

Here, we present a protocol that enables fast, robust, and cheap fabrication of tumor spheroids followed by hydrogel encapsulation. It is widely applicable as it does not require specialized equipment. It would be particularly useful for exploring spheroid-matrix interactions and building in vitro tissue physiology or pathology models.

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Genetik olarak tadil edilmiş hücre transplantasyonu için Micropatterned kültür plakalarında Sferoid hücrelere karşı gene

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

Eşleştirilmiş boncuk ve mıknatıs dizi Microwells değişken içbükey geometrileri ile kalıplama için

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Sferoid-Matriks Etkileşimlerini İncelemek için Polietilen Glikol Hidrojellerde Tümör Sferoid Üretimi ve Kapsüllenmesi