Bu çalışma BBSRC (BB/1006478/1) tarafından kısmen finanse edildi. PRR Royal Society Üniversitesi Araştırma Bursu almıştır.

1.. Stratejik Düşünceler <ol><li> Mikro-deney için kullanılan tohum kristallerinin seçimi deney nesnesine bağlı olarak değişecektir. Bir projenin başında o kristal optimizasyonu için alternatif başlangıç ​​noktaları sağlayabilir çeşitli kristalleşme hit bulmak için yararlı olur. iyi kalitede kristaller rahatsızlık ya da aşağıdaki sistem denge döner nükleasyon burada bölgede yani faz şeması, metastabl bölgede büyümeye daha muhtemel olduğu için RMMler büyük ölçüde kristal optimizasyonu için olan ihtiyacı azaltır. Bu nedenle ilk kristalleri kısa sürede (ilk kristaller büyüyen durdurmak gibi, daha doğru, ya da) elde edilir gibi rutin kısa sürede RMMler kullanmanızı öneririz. </li><li> RMMler ilk tur için, tohum stok mümkün olduğu kadar çok kristalli bir malzeme ile yapılmalıdır. Sadece bir iyi varsa o kristalleri içeren veya kristaller küçük, eğer birden fazla tekrarlar kurmak yararlı olabilirkristallerin arzını artırmak için (tohumlama olmadan) orijinal hit. Bununla birlikte, pek çok farklı isabet elde edilir ise, tohum kristalleri çeşitli koşullarda hasat edilir ve bir arada karıştırılabilir. </li><li> Faz ayrılmasını önlemek için, yüksek tuz koşullarında yetiştirilen kristalleri yüksek PEG koşullarında yetiştirilen kristallerinden ayrı hasat edilmelidir. Birkaç kuyulardan kristaller karıştırılır ise, tuz kristalleri vermek üzere daha az olasıdır bir çözelti, tohum süspansiyonu için seçilmelidir. Örneğin, fosfat, sülfat, kalsiyum ve magnezyum, yüksek dozlarda kaçınılmalıdır. </li><li> Daha sonra bir projede bu kırınım geliştirmek çiftli kristaller önlemek ve ligandları bağlamak için uygun olan kristaller elde etmek için farklı bir birim hücre kristaller aramak için önemli olabilir. Bu aşamada (örneğin, en iyi kırılmaktadırlar olanlar) sadece en uygun tohum kristalleri stok yapmak için kullanılmalıdır. Mikro-Bazen tekrarlanan mermi nerede sadece &quot;iyi, gerekli&quot;Kristalleri, bir sonraki tur için ekim stok yapmak için kullanılır. Mümkünse,&quot; PEG 3000 gibi nötr &quot;yeni bir kristal çökelti temas teşvik etmek ve yüksek olarak kararsız olabilir kompleksleri kristalize için tohum kristalleri askıya almak için kullanılmalıdır -tuz çözeltileri 12. </li><li> Tek bir kristalleşme durumdur kullanılan klasik mikro-deneyleri, umut verici bir durum ve sonraki optimizasyonu sırasında kimlik aşağıdaki sıklıkla faydalıdır. Bu damla başına kristallerinin istenen sayısını elde etmek için tohum stok sulandırmak için genellikle gereklidir. (Artan seyreltme tohum stoklarının bir dizi bir kristalizasyon eklenir) bir &quot;birleştirici&quot; mikro-deney tohum stoku optimum seyreltme oranını bulmak için hızlı bir yöntemdir. Bu yaklaşım, aşağıda tarif edilmektedir. </li></ol> 2. Tohum Stok hazırlanması <ol><li> Bir Bunsen alev kullanarak cam Pasteur pipeti bir yuvarlak cam soruşturma yapmak. <ol><li> Yumuşak hale gelinceye kadar ortasına yakın pipet ısıtın, sonra hızla alev çıkarın ve uçlarını ayrı çekerek dışarı çizin. Aşağı 0.25 mm altında bir çapa cam çekmek için hedefliyoruz. </li><li> Bu yaklaşık 0.25 mm olan ve kısa bir süre alev içine kırık ucu dalma noktasında cam kırın. ~ 0.75 mm&#39;lik bir çapa ucunda oluşturulur ile cam bir hemisfer kadar bu işlemi tekrar edin. Uygun şekilde 0.01-1.0 mm ölçekte katı nesnelerin çarpıcı için boyutlandırılır ve bir kristalizasyon tepsi alt oyuk ya da lamel plastik yüzeyine zarar vermez gibi bu prob, kristal halinde malzemeyi kırmak için yararlıdır. Kristalleri, cam ve plastik arasında sıkışıp çünkü büyük sondalar (~ 1.0 mm) daha etkili küçük kristaller ezmek olabilir. </li></ol></li><li> Buz üzerinde tohum Boncuk ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> Binoküler mikroskop veya kristal görüntüleme sistemi kullanılarak önceden belirlenmiş kristalleşme tepsisini kontrol edin ve bir veya daha fazla ap seçintohum stok üretimi için kristal malzeme hasat için hangi tepsiden kuyuları propriate. Herhangi bir malzeme ince iğneler, kürecikler, mikro kristalleri ve düzensiz, kötü biçimli kristallerden de dahil olmak üzere kullanılabilir. Büyük malzeme, kısmen çapraz bağlanmış olması daha muhtemel olduğu gibi tohum stoku, böylece tohum deneylerde kullanım için uygunluğu azaltarak, en kısa sürede mümkün olan en kristaller artan durdurduktan sonra yapılmalıdır. Herhangi bir şüphe hasat edilecek olan kristal malzeme iyi bir UV floresan mikroskop ya da görüntüleme sistemi, açılmadan önceki kullanılarak görüntülenebilir, veya, kristalin malzemenin bir in-situ X-ışını kırınım analizi için tabi tutulabilir bir tuzu ya da protein olup olmadığı konusunda varsa Tepsiye. UV ışınlaması altında floresan olacak eski yaklaşım protein kristalleri kullanırken, tuz kristalleri renksiz görünür. </li><li> Iyi seçilmiş kristalleşme tepsisini açın. 96-çevresinde de üst plastik sızdırmazlık levha kesti damla tepsilerini oturan için usi iyi seçilmişBir neşter bıçak ng. 24-iyi asılı damla tepsiler için bir cımbız kullanarak lamel kaldırmak. Lamel ters çevirin ve istikrarlı temiz bir yüzey üzerine koyun. Rezervuar çözeltisi 50 ul çıkarın ve boru boyunca buz üzerinde kalmasını sağlamak tohum boncuk içeren mikrosantrifüj tüpüne bu sıvıyı transfer. </li><li> İyice mikroskop altında sonuçlarını görüntüleme, bölüm 2.1 &#39;de hazırlanan cam sonda kullanılarak, subwell (96 oyuklu tepsi), lamel (24-çukurlu tabla) damla olarak kristaller ezmek. Küçük kristaller iyice ezmek için birkaç dakika sürebilir. Bu adım, deneyci kristaller tuz kristalleri olduğu da ezmek için kolaydır ve bu yüzden, çapraz bağlantılı değildir, ve bu kontrol sağlar. Tuz kristalleri duydum ve onlar ezilmiş zaman hissedilebilir bir ayırt edici tıklayın üretirler. Kristaller taze malzeme elde edilir ve kullanılır denemek ezmek için sert ve zor ise. </li><li> Tohum Boncuk tüp ve t rezervuar çözeltisi 5 ul kaldırransfer eşdeğer alt oyuk (damla deneyi oturma) ya da lamel (asılı damla deneyi) hasat edilecek olan, kristal halinde malzemeyi ihtiva eden için. Mümkün olan en alt iyi ya da lamel içindekiler kadar yeniden askıya almak için, bu sıvı yukarı ve aşağı 5-6 kez Pipet. Tohum Boncuk tüp süspansiyon dönmek ve çok kristalli malzeme mümkün olduğunca hasat sağlayarak, iki kez daha bu adımı tekrarlayın. </li><li> Buz üzerinde tüp soğutmak için her 30 saniye durma, iki dakika için tohum boncuk vorteksleyin. </li><li> 4, her bir aşamada 10 kadar bir faktör ile çözeltide tohum stok seyreltilmesi, bir seyreltme serisi yapın. Tipik olarak, çok fazla kristal seyreltilmemiş tohum stokları kullanılıyorsa elde edilen, yani oyuk başına kristallerinin sayısını kontrol etmek için seyreltilmiş tohum stokları kullanmak olacaktır. Tohumların konsantrasyonu daha fazla kristalleşme vurur elde edilecek beri RMMler ilk turda, o tohum stok solüsyonu sulandırmak için önemli değildir. </li><li> Bu derhal kullanılmak üzere değilserilmesi, bir -20 ° C tohum stok süspansiyonu ile sulandırılmış tohum stokları transferi, ya da depolama için -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya. Küçük hacimli alikotları örneğin, 10-20 ul, bu malzemeyi depolamak, tohum stoku etkinliğini azaltabilir ki, tekrarlanan donma-erime döngülerinden önlemek. Dondurulmuş kez ihtiyaç kadar, tohum stoklarının süresiz muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Kristalizasyon Tepsi kurulması <ol><li> Kristalleşme tesisleri ve deneyci tercihleri ​​mevcudiyetine bağlı olarak, RMMler kristalleşme tarama oturan damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak asılı damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak 24-kuyu tepsileri, veya 96-kuyu tepsileri kullanarak yapılabilir. RMMler için kristalizasyon tepsiler robotik işleme bir sıvı dağıtıcı ya da ikisinin bir kombinasyonu kullanılarak, elle ya da kurulabilir. </li><li> Elle kurulmuş tipik bir RMMler deney, 1.0 ul protein çözeltisi, 1.0 ul kristalleşme durumu ihtiva edecek ve0.5 ul tohum stok. Bir kristalleşme robot kullanarak kurmak tipik bir deney, 0.3 ul protein çözeltisi, 0.2 ul kristalleşme durumu ve 0.1 ul tohum stok içerecektir. </li><li> 24-çukurlu damla tepsiler askıdaki RMMler tarama gerçekleştirmek için, ilk olarak, bir el pipet kullanılarak, 4 x 24 oyuklu pregreased kristalleştirme her kuyuya, 10 ml bir tüp biçiminde bir 96 oyuklu durum kristalleşme ekranından her bir durum içinde 300 ul transfer tepsiler. <ol><li> Her ikisi de ön ve arka koruyucu alt şeritler çıkarılınca edilmiş olan karşılık gelen bir plastik lamel yüzeyi üzerine her bir 300 ul her bir hazneden kristalizasyon transferi 1 ul. </li><li> Her bir kristalizasyon durumunun 1 ul için kristal tohum stoklar 0.5 ul ve ardından protein çözeltisi 1 ul ekle. Sıvı damla aşağı doğru bakan ve de uygun yukarıdaki pozisyonu olduğu gibi her lamel ters çevirin. </li><li> Aşağıya lamel basın, seali sıkıştırılmasıyağ ng güvenli bir yalıtım oluşturur. Bir kere 96 damla kurulmuş, tepsi genellikle depolama için yaş aralığı 4-18 ° C, bir inkübatör veya sabit sıcaklık odasında transfer edilmelidir. </li></ol></li><li> 96 oyuklu damla tepsisi ilk olarak her bir kristalleşme tepsinin de karşılık gelen derin kuyu blok biçiminde, 96 oyuklu bir durum kristalleşme ekranından her bir durum 20-50 ul transfer oturma RMMler tarama yapmak için. Bu transfer adımı, 8 kanallı pipet kullanarak, bir kristalizasyon robot ya da manuel transferi kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> Elle veya 3.1 ayrıntılı hacimleri kullanarak bir robot ile damla transfer rezervuar, protein ve tohum stok çözümleri. Bazı ticari kristalleşme robotlar kesiciyi temas etmezler ve böyle bir sistemi kullanarak bir performans tohum hisse devir ipuçlarını veya ilgili boruları dağıtım tıkanmasına neden olabilir. Dağıtma sırası değişkendir: Bazı robotlar aynı anda tüm çözümleri dağıtmak. Eğersonra stok tohum, rezervuar sonra, ilk protein dağıtmak, bu, mümkün değildir. </li><li> Robot tevzi bir temas, kör bir iğne ile donatılmış bir düşük hacimli bir cam şırınga kullanılarak tohum mevcut transfer değilse. Daha sonra her bir damla halinde, tohum dağıtım stok rezervuar çözelti içinden geçirilerek iğne durulayın. </li><li> Şeffaf sızdırmazlık sayfasını kullanarak tepsiyi Seal ve bir inkübatör veya depolama için sabit sıcaklık odasında transfer. </li></ol></li></ol> 4. Kristalizasyon Tepsi Muayene <ol><li> Binoküler mikroskop ya da bir kristal görüntüleme sistemi kullanılarak tüm kristalizasyon deneyleri gözünüzde canlandırın. İlk madde genel görünüşüdür derinliği boyunca, kullanıcı daha fazla kontrol ve ikinci daha büyütme derecesini elde edilir, ancak daha fazla zaman alır. </li><li> Sırayla her sub-well/coverslip incelemek ve kristal oluşumu herhangi bir kanıt kaydedin. Deneyler her 24 kurulmasını takiben 5 gün boyunca saat ve kontrol edilmelidirn daha sonra bir kez kadar 4 hafta boyunca her 7 gün. </li><li> Optimum kırılma kaliteli kristaller üretilmektedir önce RMMler birden döngüleri genellikle gereklidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda RMMler protein kristalleşme taraması için genel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntemi kullanarak, iki test proteinleri kristalleşme başarı oranında önemli bir artış ile göstermiştir. RMMler olmayan RMMler yöntemlerle üretilen kristaller bir alt kümesi senkrotron radyasyonu kullanılarak kırınım analizi, önceki yazarlar iyi kalitede kristaller RMMler deneylerde 11 büyümeye daha fazla olduğunu rapor olmasına rağmen, her iki yöntemi kullanılarak yetiştirilir...

Perutz, Kendrew ve yapısal genomik konsorsiyumların, modern yüksek kapasiteli otomatik boru hatları, hemoglobin ve miyoglobin yapılarını belirlemede işçiler ile ilk uygulamadan, makromoleküler X-ışını kristalografisi bize protein dünyasına görülmemiş bir yapısal bir bakış tanınan vardır . Bu teknik, atom at protein yapısının doğrudan görselleştirme izin en yaygın uygulanan deneysel yöntem kalır, ya da (yani 1-3 Å aralığında) atomik çözünürlükte yakın. Bir proteine ​​uygulanacak X-ışını difraksiyonu için bir ön gereklilik, ilk kristalize olması gerektiğini, ve bu kırınım yöntem 1, 2 ile yapı belirlenmesinde büyük tek oran-sınırlayıcı aşama kaldığı işlemin bu aşamasıdır. Bizim protein kristalleştirme sürecinin anlaşılması ve kristalizasyon ekranlarının kalitesi ve kullanılabilirliği önemli gelişmeler önemli gelişmelere rağmen,tepsiler ve ilgili teknolojiler, güvenilir kristalleşme başarının 3 olasılığını tahmin etmek imkansız kalır. Biyokimyasal ve Biyofiziksel yöntemler ilgi görüntüler bir kristal protein çekirdeklenme ve büyüme için elverişli özellikleri, yani iyi katlanmış, homojen, tek dağılımlı, vs olup olmadığını değerlendirmek için uygulanabilir, ancak, hiçbir şekilde bu anlayış kristalleşme kesin bir belirleyici sağlamak eğilimi. Tohum uzun mevcut kristal veya kristal malzemenin 4-7 sayısı, boyutu ve kaliteyi artırmak için uygun bir yöntem olduğu iddia edilmiştir. Bu yaklaşım kristal çekirdeklenmesini destekleyen bir durumdur sonraki kristal büyümesi ve tersi için optimal olmayabilir önermesine dayanır. Başka bir durum nucleatedi malzemeyi aktararak, kimse, bu süreçlerin etkin ayrılabilmesi için yeni, henüz keşfedilmemiş kristalleşme alanı böylece veren erişimi deneyebilirve bunun sonucu olarak bir tarama deneyinin genel başarı oranı artmaktadır. Kurulan yöntemleri, genellikle, örneğin kullanılarak yönlü basınç uygulaması ile elde edilen (i) macroseeding, bir 8 bir durum bütünüyle tek bir kristalin transferi, (ii) bir çizgi ekim, çekirdekli malzeme transferi için belgelenmiştir Yeni bir kristalizasyon damla 9, ve (iii) &quot;klasik&quot; mikro-ile bıyık sonraki geçişi ve ardından var olan bir kristal, yüzeyine bir kedi bıyık, hasat tarafından üretilen kristal &quot;tohum&quot;, transfer kristaller (ya da kristal halinde ezilmiş Tohumlar 10 vermiştir benzer koşullar malzemesi). Özellikle bu yöntemlerin her üç örneği, modern sıvı kullanım kristalleştirme ile elde robotik ne göre, zaman alıcı ve kötü ölçeklenebilir. Bu faktörler algı, en azından belli bir düzeyde, katkıda bu tohuming diğer yaklaşımlar meyvelerini başarısız olduğunda, yalnızca ziyaret edilecek bir yöntemdir. Rasgele matris mikro-(RMMler) yüksek verimli tarama ve ölçeklenebilirlik 11-13 olanlar ile geleneksel mikro-avantajlarını birleştiren yeni bir metodolojik bir yeniliktir. Bu yaklaşım, bir standart 96-durum kristalleşme ekran içinde her sub-well/coverslip üzerine / içine örnek edilebilir çekirdekli kristal bir malzemeden üretilen bir tohum stoku nesil dayanır. Bu yöntem, her iki el ile ya da 24-kuyu veya 96-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla buharı difüzyon deneyleri, oturma ya da asılı için de geçerlidir. RMMler önemli ölçüde kristalleşme başarı oranını artırmak ve daha fazla kırınım kalite ve miktar 11, 13, 14 kristallerini üretmek için deneysel olarak gösterdi, ve o de yaklaşımların crystallographers &#39;cephanelik yeni bir araç temsil edilmiştirkristalleşme başarı yolunda çaba ngoing. Burada RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır ve bu tekniğin etkinliğini gösteren örnek veriler sağlar.

<table><tbody><tr><td>MRC 96 well crystallization trays</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD11-00-100</td><td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td></tr><tr><td>ClearView sealing sheets</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD6-01S</td><td></td></tr><tr><td>Hen egg white lyzozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>~95% purity</td></tr><tr><td>Bovine liver catylase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>&amp;gt;95% purity</td></tr><tr><td>Xylanase</td><td>Hampton Research</td><td>HR7-104</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7630</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1512</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus HT-96 screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-40</td><td>For screens established by robot</td></tr><tr><td>PACT premier HT-96 screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-36</td><td>For screens established by robot</td></tr><tr><td>Morpheus HT-96 screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-47</td><td>For screens established by robot</td></tr><tr><td>Crystal Ph&amp;#8211;nix liquid handling system</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>602-0001-10</td><td></td></tr><tr><td>Seed bead kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Binocular stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2646-100EA</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 0.1-2.5 &amp;mu;l pipette</td><td>Starlab</td><td>S7100-0125</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 2-20 &amp;mu;l pipette</td><td>Starlab</td><td>S7100-0221</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 100-1000 &amp;mu;l pipette</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-37</td><td>For screens established by hand</td></tr><tr><td>PACT premier screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-29</td><td>For screens established by hand</td></tr><tr><td>Morpheus screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>For screens established by hand</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5415-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CrystalClene coverslips 18 mm</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD4-17</td><td></td></tr><tr><td>2 ml glass Pasteur pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z722669</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>24 well XRL crystallization tray</td><td>Molecular Dimensions Limited</td><td>MD3-11</td><td>For screens established by hand</td></tr><tr><td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Rasgele microseed matris taraması (RMMler) tohum kristalleri rasgele ekranlar ilave edildiği bir protein kristalleştirme tekniktir. Kristaller, bir protein faz diyagramının metastabl bölgede büyüyecek olasılığını artırarak, ilave kristalizasyon yol genellikle üretilen kristallerin kalitesi artırılabilir, elde edilir ve veri toplama ve ıslatma deneyler için kristallerinin iyi bir besleme sağlanır. Burada el ile ya da 96-kuyu veya 24-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla oturma veya asılı damla buharı difüzyon deneyleri, ya da uygulanabilir RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır.

Bir RMMler deney (A) Örnek RMMler tarama etkinliğini göstermek için, biz tavuk yumurtası beyaz lisozim (HEWL) ve sığır karaciğer katalaz (BLC) kristalizasyonuna için bu yöntemi uygulanır. Bu enzimler fazlasıyla kristalize olan ve yapısal olarak iyi hedefleri 15, 16 karakterize edilir hem de. Böyle iki RMMler ile elde geliştirilmiş kristalleşme başarı oranını göstermek için mükemmel denekler sağlamak gibi. Kristalizasyon deneyleri 96-sıra sıvı taşıma rob...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Burada, rasgele microseed matris taraması için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin önemli, protein kristalleşme tarama deneylerin başarı oranını artırmak için optimizasyon ihtiyacını azaltır ve veri toplama ve ligand-ıslatma deneyler için kristaller güvenilir bir kaynağı sağlamak için gösterilmiştir.

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

17.8K Görüntüleme.  University of Bristol.  Burada, rasgele microseed matris taraması için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin önemli, protein kristalleşme tarama deneylerin başarı oranını artırmak için optimizasyon ihtiyacını azaltır ve veri toplama ve ligand-ıslatma deneyler için kristaller güvenilir bir kaynağı sağlamak için gösterilmiştir. 

Video: Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Biyokimya

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Kimya

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction phase problem. Novel structures that lack a suitable homology model are often derivatized with heavy atoms to provide experimental phase information. The presented protocol efficiently generates derivatized protein crystals by combining random microseeding matrix screening with derivatization with a heavy atom molecule I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid). By incorporating I3C into the crystal lattice, the diffraction phase problem can be efficiently solved using single wavelength anomalous dispersion (SAD) phasing. The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows for rapid validation of a correct anomalous substructure. This protocol will be useful to structural biologists who solve macromolecular structures using crystallography-based techniques with interest in experimental phasing.

This article presents a method to generate protein crystals derivatized with I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) using microseeding to generate new crystallization conditions in sparse matrix screens. The trays can be set up using liquid dispensing robots or by hand.

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Biyoloji

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Protein Kristalizasyonu için Yüksek Verimli Tarama

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

Yazar Gündemi: Protein Kristalografisi için Kristal İsabetler Elde Etmek için Yüksek Verimli Tarama  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama