Biz pLPCX-Histon H2-GFP plazmid sağlamak için S. Taylor minnettarız. Biz sürekli destek için R. Mertelsmann ederim. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir.

1. Mikroskop Odası Slaytlar üzerindeki U2OS tabanlı Siklin B-SNAP Reporter Hücreleri (Klon 11 Hücreler 6) Tohum <ol><li> En az 48 saat süreyle günlük aşamada uyumsuz büyümeye izin verildi subconfluent SNAP muhabiri hücreleri Trypsinize. </li><li> 8 sıra mikroskop odaları (hücre sabiti dağıtımı) ile çalışma. </li></ol> Mikroskop bölmesinin bütün yüzey, santrifüj 10,000 hücreler boyunca sabit bir dağıtım az 8 iyi mikroskop odaları üzerine hücre tohumlama ve kırmızı fenol içermeyen normal büyüme ortamının 350 ul (% 10 fetal bovin serumu, penisilin / streptomisin ile takviye içinde tekrar süspansiyon için ve sodyum piruvat). Mikroskop odası (Şekil 2) hücre süspansiyonu aktarın. 8 sıra mikroskop odaları (merkezi maksimum hücre yoğunluğu) ile çalışma. Mikroskop chamb merkezinde daha yüksek bir yoğunlukta hücreler tohumlanması içiner, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta 300 ul odasına yerleştirin. Mikroskop odası merkezi (Şekil 2) dikkatlice 5.000 hücreleri ekleyin. 96 özel optik levhalar (hücre sabiti dağıtımı) ile çalışma. De, tüm yüzeyi boyunca sürekli bir dağılımı 96 kuyucuğu üzerine hücrelerin tohumlama için 5.000 hücreler santrifüj ve fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta 300 ul tekrar süspansiyon haline getirin. 96 çukurlu bir levha için hücre süspansiyonu aktarın. Gerekli hücre içeren kuyu toplam sayısına bağlı olarak, hücre sayısı ve süspansiyon ortamının toplam hacmi (Şekil 2) ayarlayın. 96 özel optik levhalar (merkezinde maksimum hücre yoğunluğu) ile çalışma. 96 plakalar üzerine hücre ekimi için, dikkatli bir smal fenol red-free normal büyüme orta 15 ul 1.500 hücreleri ekleyiniyi merkezi (Şekil 2) ile hücre büyümesini sınırlandıran elde etmek için her bir kuyucuğa merkezine l damla. <ol start="3"><li> Çekirdekli hücreleri standart hücre kültür koşullarında (37 ° C,% 100 nem,% 5 CO2) altında en az 18 saat süreyle büyümesine izin verin. </li></ol> 2. SNAP Substrat ile Muhabir Hücrelerin boyanması <ol><li> Öncesinde boyama işlemi başına 30 dk fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta alikotları 37 kadar ısınmasını bekleyin ° C </li><li> SNAP yüzey işlemesini kolaylaştırmak için (bizim durumumuzda TMR Star) -20 ° C&#39;de saklanabilir 400 mcM stok solüsyonu, bir konsantrasyon elde etmek DMSO TMR Yıldızlı çözülür </li><li> Boyamadan önce, 1 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için etiketleme fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) 200 ul içinde TMR Yıldız stok çözeltinin 0.5 ul seyreltin. </li><li> Uyumsuz büyüyen hücrelerin normal büyüme ortamı çıkarın ve l inkübestandart kültür koşulları altında 25 dakika boyunca ortam abeling. </li><li> Fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) ile orta ve yıkama hücreleri dört kez etiketleme çıkarın. 30 dakika için fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) 300 ul hücre inkübe edin. Önce mikroskop taşımadan rezidüel ilişkisiz SNAP substrat kaldırmak için taze fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C), orta değiştirin. </li><li> Bir önceden ısıtılmış bir styrofoam kutu içinde mikroskop için Aktarım hücreleri (37 ° C) sıcaklık değişimi en aza indirgemek için ısı blok. </li></ol> 3. Floresan Yoğunluğu Ölçümü <ol><li> Önceki analiz için iki saat ° C kuru modunda istenilen sıcaklık bütün bileşenleri ile tüm mikroskop getirmek için 37 iklim odasının hava sıcaklığını ayarlamak. Ön ısıtma nem ayarlamadan önce mikroskop yoğuşma ve sonraki hasarı önlemek için önemlidir. </li><li> Hava nemi t ayarlayıno% 60 ve analiz başlangıç ​​önce CO 2-5%. </li><li> Tarama ^ R Toplama yazılımını başlatın ve standart ayarlar (bkz. Tablo 1) tanımlayabilirsiniz. </li><li> Analiz edilecek kuyuların konumlarını tanımlayın. </li><li> Dt (iktisap çevrim süresi) ve iktisap döngüleri mutlak sayısını tanımlayın. </li><li> Kuyuların daha yüksek bir dizi analizi istenirse, donanım otofokus seçmek, aksi halde tek başına yazılım otofokus kullanmak için yeterlidir. </li><li> Edinimi başlatın ve ilk iki satın alma döngüsü için denetleyecek. Filtre değiştirilir ve buna karşılık gelen görüntü TMR Yıldız (Şekil 3) elde edilir önce mikroskop bu kanal içinde bir birinci görüntü sonraki toplama ile, histon H2-GFP sinyali üzerine odaklanacaktır. Bu tekrar sonraki döngüsü tekrarlanmadan önce, iyi içinde ve incelenmesi gereken kuyuların her biri için tüm pozisyonlar için tekrarlanır. </li></ol> 4. Proteolitik Profiller u analiziTarama ^ R şarkı <ol><li> Tarama ^ R Analiz yazılımını başlatın ve hücre çekirdekleri ile görüntüleri analiz olarak sinyal şiddeti ve komşu hücreleri ayıran yardımcı olmak için bir dönüm algoritmasına dayanan bir eşik kullanarak, ana nesne olarak tanımlanan histon H2-GFP, gözlemlenmiştir. Sitoplazma ile bir çekirdek içeren bir subobject TMRstar analiz için oluşturulmalıdır. (Ana nesne Önemli özellikleri X ve Y konumlarını, saat ve maksimum ve ana nesne ve TMRstar altnesnesi için alanına bölünmesiyle toplam yoğunluğunun GFP yoğunluklarını demek.) Bu analiz işlem büyük veri nedeniyle birkaç saat sürebilir miktarları. </li><li> Analiz ana nesneleri (Şekil 4) atanan zamanla altnesnesi ortalama TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu (hücre izleri), görselleştirmek modu iz değiştirin. Incelenmesi gereken hücre sayısı en az 140 devir süren bu ölçümlere gating ile ve H2-GFP yüksek bir maksimum yoğunluğu ile daralmış olabilir. Lookinghücrelerin daha fazla sayıda bir ilk temsilcisi ve objektif bakış (Şekil 4) sağlar. </li><li> Tek hücre düzeyinde (Şekil 5A) aynı anda histon H2-GFP ve TMR Yıldızlı floresans görselleştirmek için ilgi bir hücre iz seçin. </li><li> Ilgi bir hücre üzerinde sağ klik kullanarak ve histon H2-GFP ve siklin B-SNAP her zaman noktası için TMR Star illüstrasyon için verilebilir bir resim galerisi oluşturmak. </li><li> Tarama ^ R Analiz yazılımı ve kapısı ilgi hücresi X vs Y nokta arsa (Şekil 5B) temsil edilmektedir bölgenin nüfusu moduna değiştirin. </li><li> Geçitli bölgeye yeni bir nokta çizim penceresinde Uygula ve zamanla TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu (Şekil 5C) demek görselleştirmek. </li><li> Daha fazla hesaplama için Microsoft Excel İhracat verileri (zaman ve floresan yoğunluğu). </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Incirure 5D ve 5E bir hücre bir TMR Yıldız floresans yoğunluk eğrisi ile temsil siklin B kinetiği, Resmedeceğiniz kromozomal kayma belirtileri (Şekil 5E) olmadan normal mitoz yoluyla ilerler. Hücre prometafaz 6 girdiğinde izomorf penceresi (diyagramdaki parlak bölge) ulaşılana kadar nükleer zarf dökümü (NEBD gibi kırmızı üçgen ile gösterilir) takiben sitoplazma sıkıştırma üzerine, TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu ani bir artış gösterir. Floresan yoğunluğu profaz ve metafaz hücre aracılığıyla ilerledikçe sürece istikrarlı bir düzeyde kalır ve daha sonra tüm kromozomlar (Şekil 5D ve 5E) istikrarlı bir metafaz plakası kurduk sonra hızla düşmeye başlar. Bu düşüş anafaz (eğri üzerinde mavi nokta) sırasında kromozom ayırma önce gelir. Geç mitoz yılında kromatin decondense başlar (mavi çubuk) ve floresan yoğunluğu eğrisi yaklaştığında ise hücre interfaz morfolojisi benimsermitoz (Şekil 5D ve 5E) önce plato daha düşüktür plato. <table border="1"><tbody><tr><td> Otofokus ayarları </td><td> Histon H2-GFP (ana nesne toplama ayarları) </td><td> TMR Yıldız ile etiketlenmiş Siklin B-SNAP (Satın alma ayarları) </td><td> Toplama döngü süresi Tekrarlar </td></tr><tr><td> Kaba otofokus + / -39 mikron 24 Katmanlar Güzel otofokus + / -5.4 Mikron 14 Katmanlar </td><td> GFP filtresi ayarlayın: Pozlama süresi: 100 ms Işık yoğunluğu: 25% </td><td> TRITC filtre ayarlayın: Pozlama süresi: 150 ms Işık yoğunluğu: 33.3% </td><td> 2-5 dk. </td></tr><tr><td> GFP filtresi ayarlayın: Pozlama süresi: 12 ms Işık yoğunluğu:% 12.5 </td><td></td><td></td><td> Yukarı devam analiz 48 saat (% 60 daha az hava nemi ile sınırlı) </td></tr></tbody&gt; </table> Tablo 1. Siklin B proteolizin analizi için kullanılan standart olarak ayarlar. Histon H2-GFP siklin B-SNAP floresans yoğunluğunu ölçülmesi için odak düzlem tanımlamak için bir yapı referans olarak kullanılmıştır. Birikimli fototoksisite önlemek için görüntü alma ayarlara göre odaklama işlemi sırasında düşük ışık yoğunluğu vardır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Şekil 1. Endojen protein benzer çözünme özelliklerine sahip bir kimerik siklin B türevinin ifade yoluyla siklin B proteolizin ölçüm şematik. Darbe-kovalamaca etiketleme sonra floresan yoğunluğunda azalma APC / C-aktivitesinin bir ölçüsüdür. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Şekil 2. 8 kuyu slaytlar veya 96 kuyucuğu üzerindeki hücrelerin analizi. Düzenli dağılımıiyi bir yüzey üzerinde hücreler 300 ul nihai hacim içinde yeniden süspansiyon elde edilir ve tek tek bir veya birkaç sıra el ile analiz için tanımlanan ise tavsiye edilir. Merkezi bölge içinde hücrelerin zenginleştirilmesi önceden doldurulmuş ya da hazneyi merkezine hücrelerin eklenmesi ile elde edilir. Bu tekniği farklı kuyularda otomatik görüntü elde etme durumunda tavsiye edilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Şekil 3,. Veri toplama sırası. Histon H2-GFP A) Algılama mitoz sırasında kromozom uyum odak düzlemi tanımı ve izlenmesi için kullanılır. B) TMR Yıldız floresans şiddetinin Floresan yoğunluğu siklin B-SNAP etiketli darbe takibin mutlak miktarı için bir ölçüdür. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Şekil 4. Ortalama TMR Yıldız Temsilcisi Tarama ^ R Analiz yazılım tabanlı tasvirizamanla floresan yoğunlukları (alanına bölünmesiyle toplam TMRstar yoğunluğu). temsili bir hücre trace (mavi) seçimi. Ilgili görüntüleri (sağda gösterildiği gibi) eş zamanlı görselleştirme izin histon H2-GFP (yeşil) ve siklin B-SNAP (kırmızı). <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Şekil 5. A + B) XY-nokta arsa üzerinde bir ilgi hücre temsil nokta yolluk örneği. C) zamanla ortalama TMRstar floresan yoğunluğu (alan tarafından ayrılan toplam TMRstar yoğunluğu) Görselleştirme nokta arsa kullanarak. D + E), Microsoft Excel&#39;de oluşturulmuş gibi NEBD (nükleer zarf dökümü) ve kromatin yoğunlaşması (mavi bar) arasında izomorf penceresi (diyagramda brigher alanı) siklin B-SNAP Temsilcisi floresans yoğunluk eğrisi. Anafaz t gösterilireğri üzerinde o mavi nokta. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Film 1. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz burada siklin B proteoliz ve kromozom uyum eşzamanlı izleme kolaylaştıran bir canlı hücre görüntüleme tabanlı bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yaklaşım mitotik kontrol çalışması tek hücre düzeyinde hücre popülasyonu soğukkanlı sağlar. Siklin B degradasyon eğrileri APC / C aktivitesini doğrudan içten kolaylaştırmak ve böylece dolaylı SAC 6 durumunu yansıtmaktadır. Bu yaklaşım, olsa Tarama ^ R yazılım dayalı kurulan, kolayca herhangi bir karşıl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Ürünün Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Reporter hücre hattı </td><td> üretilen in-house olarak 6 tarif </td><td> 11 muhabir hücreler klonu (U2Os bazlı siklin B-SNAP eksprese eden hücreler) </td><td></td></tr><tr><td> Retroviral siklin B-SNAP ifade vektörü </td><td> üretilen in-house olarak 6 tarif </td><td> pLNCX2-siklin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred içermeyen DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> FCS, sodyum piruvat, penisilin / Streptococcus bil takviyesi gereklidir </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Yıldız </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> DMSO içinde Stok çözeltisi 400 uM </td></tr><tr><td> Özel Opstics Tabak iyi 96 </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slayt 8 kuyu, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskopi ünitesi </td><td> Olimpos </td><td> İklim odası ile IX-81 ters mikroskop </td><td></td></tr><tr><td> Nesnel </td><td> Olimpos </td><td> UPLSAPO 20x objektif (NA 0.75) </td><td></td></tr><tr><td> Toplama yazılımı </td><td> Olimpos </td><td> Tarama ^ R Toplama yazılımı (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analiz yazılımı </td><td> Olimpos </td><td> Tarama ^ R Analiz yazılımı (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Hücre bölünmesi sırasında iki yavru hücre arasında kromozomların eşit dağılımı genetik değişmezlik 1 garanti için bir ön koşuldur. Kromozom ayrılması sırasında yanlışlıklar malignite bir işaretidir ve ilerleyici bir hastalık 2-4 ile ilişkilidir. Mili montaj noktası (SAC) her kromozom mitotik iğ 1. istikrarlı bir bipolar eki kurmuştur kadar geri metafaz hücrelere tutan bir mitoz gözetim mekanizmadır. SAC aktive müdahale ederek işlevini uygular APC / C securin ve siklin B proteoliz ve böylece kromozom ayırma ve mitotik çıkış engellemek için subunit Cdc20. Kromozomların yanlış eki SAC sinyalizasyon susturulmalarını engeller ve problemi kromozom missegregation, anöploidi ve malign büyümeleri 1 önlemek için çözülünceye kadar APC / C Cdc20 arasında devam inhibisyonu neden olur. I ele çalışmaların çoğuAPC / C-bağımlı proteoliz üzerine uygunsuz kromozomal eki nfluence mikrotübüle kromozomal eki ile etkileşime ilaçlar depolimerizasyon veya mikrotübül-dengeleyici kullanarak mili bozulması yararlandı. Mikrotübül kinetiği müdahale ulaşım ve kritik düzenleyiciler lokalizasyonu etkileyebileceğinden, bu prosedürler suni etkileri 5 inducing bir risk taşıyor. SAC mitoz sırasında APC / siklin B C-bağımlı proteoliz müdahale nasıl çalışma için hücre popülasyonlarının soğukkanlı, biz izin bir histon H2-GFP-tabanlı sistem kurulmuş metafaz mitotik kromozom uyumuna ve siklin B 6 proteolizin eşzamanlı izleme . Proteolitik profilleri tasvir etmek için, bir C-terminal parçası SNAP 6 (Şekil 1) ile bir kimerik siklin B raportör molekül üretilir. Kendi kendine etiketleme reaksiyonunda, SNAP-parçası ile kovalent bağ oluşturabilenalkylguanine taşıyıcılar (SNAP substrat) 7,8 (Şekil 1). SNAP yüzey molekülleri kolayca kullanılabilir ve değişik florokromlar geniş bir yelpaze taşırlar. Kimerik siklin B-SNAP molekülleri büyüme ortamı 7 (Şekil 1) zar-SNAP geçirgen alt tabakanın ilavesinden sonra etiketli hale gelir. Etiketleme reaksiyondan sonra, siklin B-SNAP floresans şiddetinin bir darbe-kovalamaca reaksiyon benzeri şekilde ve floresan yoğunlukları siklin B bozulması 6 (Şekil 1) düzeylerini yansıtacak düşer. Bizim sisteme paralel hücreleri (veya birkaç hücre popülasyonlarının) çok sayıda mitotik APC / C bağımlı proteolizin izlenmesini kolaylaştırır. Böylece, sistem aracıları / geçiş anafaz için metafaz de proteolitik aktiviteyi bozar edebiliyoruz küçük moleküller belirlemek için değerli bir araç olabilir. Ayrıca, mitoz sırasında siklin B sentezi gibi son zamanlarda önemli bir mechanis olarak öne sürülmüştürstabil siklin B ekspresyon düzeyleri 9,10 tutarak farelerde ve insanlarda bir mitoz blok teşvik m, bu sistem bize dengeli bir denge 6 bir unsuru olarak siklin B proteoliz analiz sağladı.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

studying-proteolysis-cyclin-b-at-single-cell-level-whole-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Görüntüleme.  University Medical Center Freiburg. Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Video: Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Genetik

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Biyokimya

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Gelişim Biyolojisi

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Biyomühendislik

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biyoloji

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).