Biz özellikle Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau ve Mandy Roscher yılında, DKFZ virüs üretim ve geliştirme biriminin ekip teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen Eğitim ve Araştırma (BMBF) ve Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est Uygulamalı Tümör Viroloji ortak Programı çerçevesinde Helmholtz Topluluğu Federal Bakanlığı tarafından desteklenen hibe edilmiştir.

Biyogüvenlik düzeyi 2 olan bir laboratuvar rekombinant parvoviruses (recPV) üretimi için gerekli olduğunu unutmayın. Protokol, iki ana bölümden ayrılır. Birinci kısım (transfeksiyon ile recPV üretimi) protokolü ikinci bölümü (enfeksiyonu yoluyla recPVs üretiminde) inokulum olarak hizmet recPVs minimal miktarda üretmek için gereklidir. Bir kez recPVs küçük bir miktar protokolünün birinci bölümü atlanabilir, üretilen ve rekombinant parvovirüsü, sadece adenovirüs helper yoluyla parvovirüsü kapsid proteinler (bkz. aşağıda) için gen kodlaması sağlayan enfeksiyonu yoluyla amplifiye edilebilir. 1. Transfeksiyon üzerinden recPVs Üretimi 1.1 Viral DNA transfeksiyon Bu ya da katyonik lipidler veya kalsiyum fosfat dayalı protokol, bu bölümde oluşturulan bir DNA transfeksiyon yöntemi kullanmak mümkündür. Biz genellikle Fugene H kullanırD Transfeksiyon Reaktif. Transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için bir plazmid ifade gelişmiş Yeşil floresan proteini (örneğin pEGFP-N1, Clontech) ile ilave plaka transfekte öneririz. Hücre nüfusunun en az% 50 EGFP-pozitif 24 saat sonra, transfeksiyon sonucunda meydana transfeksiyon verimli ve virüsünün üretimi için optimal olarak kabul edilir. <ol><li> Transfeksiyon günde% 50 hücresel konfluent elde etmek için bir 10 cm plakası, içinde transfeksiyonuyla, tohum 2.000.000 HEK293T hücreleri daha önce 1 saat. % 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, 100 ml penisilin başına U ve 100 ug / ml streptomisin ilavesiyle Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 10 ml hücre büyümesi. </li><li> 1.5 ml tüp virüs verme karışımı (01:02:01 molar oranı) hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> RecPV vektörünün 3 ug ilgi transgen (EI hastayı-1-GFP 6) barındıran. </li><li> Vektör pCMV / VP 5 6 mikrogram parvovirus kapsid gen birimi barındıran </li><li> 8 mikrogram of adenovirüs kökenli yardımcı plazmid pXX6 7. </li></ol></li><li> 850 ul (20 ul / ng nihai konsantrasyon) ile serum içermeyen aracı kadar olan plazmid karışımı ile seyreltilir. </li><li> 42.5 ul Fugene HD (: mikrogram DNA 2.5:1 oranı ul Fugene) ekleyin. Orta Fugene eklerken tüp tarafında dokunmayın. </li><li> 5-10 saniye yavaşça vorteksleyin. </li><li> 30 dakika oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> Transfeksiyon karışımı hücrelere damla-akıllıca ekleyin. Eşit boyunca karışımı dağıtmak için hafifçe sallayın plaka. </li></ol> 1.2 Virüs üretim <ol><li> Hasat önce 72 saat boyunca% 92 nem,% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Bu süre içinde soyu parvovirüsü parçacıklar parvovirüsü plazmit ile oluşturulmaktadır. </li></ol> 1.3 Virüs hasat <ol><li> Bir doku kültürü davlumbaz, bir 15 içine plakadan süspansiyon, bunların orta içinde hücreleri sıyırmak ve transfer aspireml plastik tüp. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüje tüpü. </li><li> Üstte kalan% 95 çıkarın. </li><li> Vorteks tüpü yavaşça geri kalan süpernatan (0.5 ml) içine pelletini için. </li><li> -80 Azından tüp dondurmak ° C. Bu aşamada, üretim durdurmak ya protokolü ile birlikte devam etmek mümkündür. </li><li> Süspansiyon eritmeyi ve oda sıcaklığında getirmek. </li><li> 37 sıcak su, sıvı azot banyo ve çözülme içinde süspansiyon Freeze ° C Vortex gayretle 15 saniye için ve donma-çözülme çevrimi fazla iki kez tekrarlayın tüpler. </li><li> 4 azından 15 dakika süreyle 16,000 x g&#39;de santrifüje tüpler ° C. </li><li> Taze bir tüp içine süpernatant toplayın. Bu aşamada, tüp ham virüsü ekstresi preparatı içerir. </li><li> Virüs titrasyon (bkz. aşağıda) ile devam edin. GFP genini taşıyan recPV için tipik bir üretim yaklaşık 1 tekabül eden 1-3 x 10 7 viral enfeksiyon birimleri vermelidir -3 x 10 10 viral genom parçacıklar içeren. </li></ol> 1.4 Virüs depolama <ol><li> Uzun süreli saklama için -80 az ham virüs özü içeren tüp dondurmak ° C Bu protokolün bir ikinci bölümünde aşı malzemesi olarak ham viral ekstreler kullanmak mümkündür. </li></ol> 2. Enfeksiyon ile recPVs Üretimi Enfeksiyon yoluyla recPV üretim başlamadan önce, üretmek ve Adenovirüs standart protokol 8&#39;e göre parvovirus VP gen (Ad-VP yardımcısı, 5 açıklanan) taşıyan 5 arındırmak. Aynı zamanda ilgi transgen (örn., yukarıda açıklandığı gibi transfekte yoluyla üretilen) taşıyan recPVs minimal miktarda olması gereklidir. Aşağıda, 175 cm 2 şişe (T175) biçiminde recPV üretimini açıklar. Bu şekilde üretilen virüsü stokunun daha da çok katlı amplifikasyon 10 CellSTACK kültürü odalarına (Corning) içinde gerçekleştirilebilmektedirprotokolünün küçük ayarlamalar teklif ile. 2.1 Enfeksiyon <ol><li> Enfeksiyon günde% 60-80 hücresel konfluense elde etmek için bir T175 şişesi enfeksiyon, plaka 10 milyon NB324K hücreleri 1 gün öncesine. Bir kontrol olarak hücreler aynı sayıda (non-enfekte olmuş hücreler) içeren ikinci bir şişe hazırlayın. Her T175% 5 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, ml başına Penisilin 100U ve 100 ug / ml streptomisin ile desteklenmiş bir son hacim olarak Minimum Essential Medium (MEM) 20 ml sahip olmalıdır. </li><li> Ertesi sabah oluşan bir 2 ml plastik tüp içinde virüsü karışımının hazırlanması: <ol class="lalpha"><li> Enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı, enfeksiyöz birim / hücre) de Ad-VP-helper 5 = 10 (1 x 10 8 enfeksiyöz birim karşılık gelen); </li><li> MOI azından recPVs = 0.5 (5 x 10 6 enfeksiyöz birim karşılık gelir). MEM ile 1.5 ml&#39;ye tamamlayın. </li></ol></li><li> T175 şişeye birinde tamamını virüsü karışımı geçerlidir. </li><li> Inkübe37 de 2 saat için şişeye ° C,% 92 nem,% 5 CO2 yavaşça her 15 dakikada çalkalama. </li><li> 37 daha az 20-24 saat boyunca inkübe ° C,% 92 nem,% 5 CO2. </li><li> Taze ortam ile kültürel ortamı değiştirin. </li></ol> 2.2 Virüs üretim 48 saat süreyle% 92 nem,% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe şişeler. Etkin viral üretim göstergesi olarak, sitotoksisite açık işaretleri 36-48 saat sonrası enfeksiyon başlamadan, viral enfekte hücre içeren şişeyi dikkat edilmelidir. 2.3 Virüs hasat <ol><li> Bir doku kültürü olarak davlumbaz, aspire ve bir 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne şişesi orta süpernatan transfer. </li><li> 1.5 ml PBS ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> % 0.25 Trysin-EDTA 1.5 ml hücreleri Trypsinize. Çıkarıldı ve orta hücre süspansiyonu ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında, 5 dakika boyunca 5000 x g&#39;de hücreleri ve süpernatan santrifüjebelgelendiğinden. </li><li> Süpernatant atın. </li><li> Hücre topağı ve yavaşça vorteks hücreleri yeniden süspanse etmek tüpüne TE tampon 1 ml (1 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 8.7) ilave edilir. </li><li> 37 sıcak su içinde bir sıvı azot içinde çözülme banyo ve hücre süspansiyonu dondurmak ° C. 15 sn için tüp şiddetle Vortex ve donma-çözülme döngüsü üç kez tekrarlayın. </li><li> Hücre genomik ve non-paketlenmiş viral DNA&#39;lar sindirimi için, 37, 30 dakika için 50 U / ml Benzonase Nükleaz ° C ile hücre süspansiyonu Treat. </li><li> 4 de 20 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüje tüp ° C. </li><li> Taze bir tüp içine süpernatant toplayın. Bu aşamada, süpernatan ham virüsü ekstresi preparatı içerir. RecPV-GFP tipik verimleri Bu protokol 1-10 x 10 8 viral enfeksiyon birimlerinin aralığında olmalıdır takiben üretilir. </li></ol> 2.4 Virüs depolama <ol><li> 4 ° C&#39;de kısa süreli depolama için (en fazla 2 ay), mağaza virüs </li><li> Lon için-80 at g süreli saklama (daha uzun süre 2 ay), mağaza virüs ° C </li></ol> 3. RecPV Arıtma <ol><li> Ham lizatları gelen recPVs saflaştırılması için, Zolotukhin ark göre bir iodixanol süreksiz degrade çalıştırmak için önerilir. 9. Bu etkin virüsü saflaştırılması için ham özütü viral (beş T175 şişeler üretim elde) 5 ml en az kullanılarak önermektedir. </li></ol> 4. Rekombinant Parvovirus Titrasyon <ol><li> El-Andaloussi ark açıklandığı gibi recPV titrasyonu gerçekleştirmek. 5 </li></ol> 5.. Kalite Denetimleri <ol><li> NB324K göstergesi hücrelerinde parvovirüsü plak assay yürüten istenmeyen virüslerin kopyelemeye yetkin (RCV) varlığında kontrol etmek için El-Andaloussi ve ark. 5 anlatılan protokolde kullanabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar RecPVs productio bir örneğin adenovirüs genomik elemanlarının varlığında veya yokluğunda, transfeksiyon yoluyla Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Hücreler hastayı-1-GFP (a recPV GFP geni barındıran) veya hastayı-1-lusiferaz (a recPV ateşböceği lusiferaz geni barındıran) ile birlikte pCMV / VP (VP parvovirüsü kapsid proteinleri için kodlayan gen taşıyan plazmid) ile transfekte edildi ile (+ pXX6) veya olmayan (-pXX6) pXX6 plazmid (adenovirüs taşıyan E2A, E4 (orf6) ve VA RNA genleri). Ham hücre ekstreleri arasında eşit hacimde El-Andaloussi ark bildirildiği gibi hücreler ve GFP transdüksiyon ya lusiferaz deneyleri yapıldı. 5 NB324K uygulanmıştır. RecPVs üretiminde belirgin bir artış bizim yöntemi (Şekil 3A, B) takiben elde edilen yaklaşık 5 TU / hücre geleneksel protokollere göre üretim 0,3 GFP transductional birimleri (DS) / hücreden artan pXX6 varlığında elde elde edildi. RecPV verimlilik önemli bir artış (24-kat yaklaşık)ayrıca hastayı-1-lusiferaz (Şekil 3C) söz konusu gözlenmiştir. Bu sonuçlar pXX6 içerdiği genetik malzeme parvovirüsü üretimi artırmak için mümkün olduğunu göstermiştir. Enfeksiyonu yoluyla recPVs üretim temsili bir örnek, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. NB324K hücreleri çeşitli recPVs (şekilde gösterildiği) ve Ad-VP-helper (PV VP kapsid proteinleri kodlayan gen barındıran) ile ko-enfekte edildi. Kadar Ad-VP yardımcısı daha gelişmiş recPV üretime&gt; istenmeyen çoğaltma yetkili viral parçacıkların (Şekil 4B) oluşumunu artırmadan numaralı seribaşı hücre başına 70 TU (Şekil 4A). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> Şekil 1.. Vektörler özerk parvoviruses dayanmaktadır. (A) Üst: transgen VP-kodlayan genlerin kısmını değiştirir ve viral promotor P38 kontrolü altındadır. NS1 / 2 için genlerin rebakımlı ve bunların ifade viral promotör P4 tarafından kontrol edilir. Vektör genom kopyelenmesi ve rekombinant genomunun ambalajları için gerekli olan cis-etkili elementleri içeren parvoviral ITRs tarafından taarruz altında kalır. Altta: bir plazmid, (örneğin, CMV.) Ya da heterolog bir veya otolog (örn. P38.) Promoter (Px) altında VP-genini taşıyan yapısal genlerin bozulması telafi etmek için rekombinant parvovirüsü üretimi sırasında trans temin edilir Rekombinant genomunda. ITR, ters terminali tekrarlayın. Şekil 4 uyarlanmıştır. RecPVs üretimi için kullanılan klasik protokolü (B) şematik görünüm. HEK293T hücreleri geçici olarak viral DNA (vektör ve yardımcı plazmid) ve üç gün sonra transfekte edilir, hücreleri toplanır ve virüsleri hasat edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> Şekil 2. Ile recPVs üretimiAd-VP yardımcı olur. RecPV ve Ad-VP genomların (A) şematik haritalar. RecPV VP bölgenin parçası yerine bir heterolog transgen içerir. Ad-VP parvovirus VP geni barındırır. Bu makalede açıklanan protokol (B) şematik görünümü. NB324K hücreleri recPV ve Ad-VP virüsleri ile birlikte enfekte olmaktadır. Üç gün hücreler hasat edilmiş ve recPV partikülleri hücre lizatı elde edilirler sonra. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> Şekil 3. Adenovirüs tabanlı plazmidler pXX6 tarafından recPV üretiminin uyarılması. 10 cm tabaklar tohumlanmış HEK293T hücreleri, recPVs üretmek için hastayı-1-GFP (A ve B) veya hastayı-1-lusiferaz (C) ile kombinasyon halinde pCMV / VP ile transfekte edildi. Eş zamanlı olarak, hücreler adenovirüs-türetilmiş plazmidler helper pXX6 ya da olmasın, olarak belirtilen ile birlikte transfekte edildi. Üç gün sonrası transfeksiyon, hücreler üç donma ve çözülme döngüleri ile hasat ve parçalanır edildi. Rezil eşit hacimleriE virüsü özleri göstergesi hücreleri NBK uygulandı ve iletimi deneyleri yapılmıştır. (A) konfluent NB324K monotabaka içinde GFP pozitif hücreler gösteren Temsilcisi mikrografları. (B) GFP transdüksiyon tahlillerin Kantitasyonu numaralı seribaşı hücre başına transdüksiyon birimi (TU) olarak ifade . (C) lusiferaz aktivitesi Kantitasyonu nispi lusiferaz birimi (RLU) olarak ifade edilir. El-Andaloussi ark açıklandığı gibi lusiferaz yapıldı. 5. Sütunlar üç ortalama değerler standart sapma çubuklarla çoğaltır temsil eder. + PXX6 sütun üzerine numarası, (B ve C), karşılık vermeden pXX6 varlığında elde recPV virüs titreleri in kat artış gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> Şekil 4. Reklam rekombinant-VP yardımcı virüsü ile recPV üretimi uyarılması. (A) NB324K hücreleri, enfeksiyon olduğunudaha sonra İçişleri Bakanlığı 10 az saflaştırılmış Ad-VP yardımcı virüsü (Ad-X birim / hücre, Adeno-X Hızlı titresi Takımı ile titre) ile Ted ve aşağıdaki rekombinant parvovirus Chi-HH-1-EGFP 11 (0.1 biriyle süperenfekte TU / hücre) ya da H-1-GFP (0,5 TU / hücre) 5. Bir gün sonrası enfeksiyon, orta değiştirildi ve iki gün sonra, hücreler toplandı ve üç dondurma-ve-çözülme döngüleri ile parçalanır. Ham hücre ekstreleri El-Andaloussi ark göre transdüksiyon deneyi tarafından virüs titreleri belirlemek için kullanılmıştır. 5. TU, iletim birimi. (B) Ad-VP yokluğu varlığında üretilen Viral toplu NB324K göstergesi hücreleri üzerinde plak testi ile çoğaltma yetkili viral parçacıkların (RCV) kendi içeriği için analiz edildi.

<ol>
	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Biz recPV üretim adenoviral genomik elementin varlığını tarafından geliştirilmiş olabilir göstermiştir. Biz transfeksiyon ile adenovirüs genomik elemanı sağlayarak ve recPV ile kombinasyon halinde Reklam-VP-yardımcı ile 100 kat daha fazla eş-hücreleri tarafından enfekte 10&#39;dan fazla kat (0,3-5 TU / hücreden) tarafından recPV verimleri artmıştır geleneksel protokollere karşılaştırılması. Protokol daha adenovirüs genomik elemanlarının teslimat ve enfeksiyonu için kullanılmak üzere Re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nükleaz </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Hızlı titresi Seti </td><td> Clontech&#39;in </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Bu tür sıçan H-1PV ve MVM olarak Kemirgen parvoviruses (PV), küçük icosahedral, tek sarmallı DNA virüsleri vardır. Genom, sırasıyla 1, yapısal olmayan (NS1 ve NS2) ve kapsid proteinler (VP1 ve VP2) ile ifade düzenleyen iki arttırıcılar ve P4 P38 içerir. Onlar onkolitik ve oncosuppressive yetenekleri için antikanser ilaçları insanlar 2 için patojen olmayan olurken yüksek ilgi gördü. NS1 viral sitotoksisite 3 ana efektör olup. Daha da doğal antineoplastik aktiviteleri arttırmak amacıyla, bu vektörlerin gelen türevler bir terapötik transgen (örn., bir sitotoksik polipeptid, sitokin, kemokin, tümör baskılayıcı geni gibi) 4 ile kapsid proteinleri için kodlayan gen ile değiştirerek elde edilmiştir. Rekombinant parvoviruses (recPVs) vektör NS1 / 2 kodlama dizileri ve viral DNA amplifikasyonu ve paketleme için gerekli olan PV genom telomer korur. ÜretimirecPVs yalnızca tarafından üretici hücre (genellikle HEK293T), oluşur ko-transfekte VP proteinleri için kodlayan gen (Şekil 1) 4 eksprese eden ikinci bir vektör (pCMV-VP) ile hücre. Bu şekilde üretilen recPV vektörler replikasyon bozuk. RecPVs ürettikleri edilmiştir hangi ebeveyn virüsler açısından gelişmiş oncotoxic aktiviteye sahip olduğu ispat rağmen, bunların üretimi önemli bir sorun oluşturmaktadır ve güçlü anti-kanser klinik uygulamalarda bu ajanların kullanımı engellemektedir. Bu kullanımda, diğer protokollere göre daha az 10 kat recPVs üretimi geliştirilmiş HEK293T içine E2A, E4 (orf6) ve VA RNA geni (örn. pXX6 plazmid) içeren bir Reklam-5 türetilmiş vektörün bir giriş bulundu. Bu bulgu, dayanarak, recPVs üretimi artırmak için gerekli olan genomik adenoviral elemanları gibi parvovir içerdiği Reklam-VP-yardımcı olan yeni bir inşaBizi VP gen ünitesi 5. Ad-VP-helper kullanımı, rec-PV üretimi ((örneğin NB324K) olası transferinde zor olan hücre hatlarının yapımı kullanımı, viral enfeksiyon adımları (as plazmid transfeksiyon aksine) tamamen güvenir bir protokolü kullanarak verir Şek. 2). Bu büyük ölçüde nihai ürün 5 kalitesini etkilemeden, üretim süresini ve maliyeti azaltarak, üretilen rekombinant virüs miktarını arttırır bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, recPV büyük ölçekli üretim (süspansiyon hücreleri ve biyoreaktörler) artık makuldür.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems at JoVE.com

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100&#39;den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K Görüntüleme.  German Cancer Research Center (DKFZ). Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100'den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Video: Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Biyomühendislik

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Kanser Araştırmaları

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian and avian host species, including humans. With the recent advent of rotavirus reverse genetics systems, it has become possible to use directed mutagenesis to explore rotavirus biology, modify and optimize existing rotavirus vaccines, and develop rotavirus multitarget vaccine vectors. In this report, we describe a simplified reverse genetics system that allows the efficient and reliable recovery of recombinant rotaviruses. The system is based on co-transfection of T7 transcription vectors expressing full-length rotavirus (+)RNAs and a CMV vector encoding an RNA capping enzyme into BHK cells constitutively producing T7 RNA polymerase (BHK-T7). Recombinant rotaviruses are amplified by overseeding the transfected BHK-T7 cells with MA104 cells, a monkey kidney cell line that is highly permissive for virus growth. In this report, we also describe an approach for generating recombinant rotaviruses that express a separate fluorescent reporter protein through the introduction of a 2A translational stop-restart element into genome segment 7 (NSP3). This approach avoids deleting or modifying any of the viral open reading frames, thus allowing the production of recombinant rotaviruses that retain fully functional viral proteins while expressing a fluorescent protein.

Generation of recombinant rotaviruses from plasmid DNA provides an essential tool for the study of rotavirus replication and pathogenesis, and the development of rotavirus expression vectors and vaccines. Herein, we describe a simplified reverse genetics approach for generating recombinant rotaviruses, including strains expressing fluorescent reporter proteins.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.