Name: experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology at JoVE.com

Biz Lab üyeleri Jeffrey Adijanto Tina Banzon Rong Li Qin Wan, Congxiao Zhang Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Ziya, Natalia Strunnikova bu hücre kültürleri karakterize yardım için teşekkür ederim. Jing Zhao, Connie Zhi, ve Tina Banzon hücre kültürleri büyük stoklar korunmasında yardım ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Sağlık İntramural Araştırma Programı Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. İnsan Fetal Doku Bütün insan dokusu ile ilgili araştırma, Helsinki Bildirgesi ve NIH kurumsal inceleme kurulu ilkelerini izler. Fetal gözleri buz üzerinde dolu tüpler (ABR tarafından sağlanan) içeren RPMI-1640 medya yerleştirilir rastgele donörler, gebeliğin 16 ila 22 hafta, bağımsız bir pezevengi, Gelişmiş Bioscience Kaynakları (ABR, Alameda, CA) tarafından elde edilen ve bir gecede öncelikli teslimat hizmeti tarafından teslim edilir. Dokular enükleasyon sonra 48 saat kadar canlı kalır. 2. Hücre Kültürü Orta MEM-alfa modifiye orta% 5 (Sigma-Aldrich) hazırlamak için temel aracı olarak kullanılan ve RPE hücrelerinin kültür (RPE orta, aşağıda Tablo 1) için% 15 serum içeren medya. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Miktar </td><td> Depolama </td></tr><tr><td> MEM, alfa değişiklik </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 takviyesi </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> GlutaMax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Sigara esansiyel amino asitleri </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Boğa </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hidrokortizon </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 mikrogram </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu ** </td><td></td><td></td><td> % 5 veya% 15 </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tablo 1. 500 ml Orta hazırlanması için İnsan Fetal RPE Orta Bileşenleri * THT orta yapmadan önce 1 1.5 ml PBS taurin hidrokortizon triiodo-thyronin eriterek yapılır. Birden fazla alikotları -80 yapılır ve saklanır ° C kültür kültür ortamı hazırlanması basitleştirmek için. ** Fetal sığır serumu, Sigma-Aldrich veya Gibco elde değildir. Medya hazırlanmasında kullanılan fetal sığır serumu Atlanta Biyolojik (Norcross, GA) elde edilir. Her şişe serum kullanmadan önce (56 ° C 1hr) inaktive ısı. Aynı lottan serum hücre kültürü tutarlılık büyük miktarda sağlamak için ortam hazırlanması için kullanılması kadar satın alınan ve -20 ° C&#39;de saklanır. % 20 FBS içeren farklı birçok medya birkaç hafta iyi plakaları - veya 12 - 24 hfRPE hücreleri belirli bir toplu seyrek numaralı seribaşı hücreleri yetiştirilmektedir. En klasik RPE morfolojisi (arnavut kaldırımı) ile en hızlı büyüyen melanated hücreleri, hücre kültürü için kullanılabilecek uygun bir serum çok göstermektedir. Hücre kültürü ortamı da içerir: N1 takviyesi (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / ml, GlutaMax / penisilin-streptomisin 1:100 ml / ml (Gibco) ve esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / ml. Buna ek olarak, hidrokortizon (20 mg / L), taurin (250 mg / L) ve triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) 1:500 bir nihai konsantrasyonu PBS içinde eriterek, bu üç bileşenin önceden hazırlanan (ml / ml). THT, Alikot 80 saklanır ° C kadar RPE orta eklendi. 3. Hücre Kültürü Alındıktan sağlam küreler antibiyotik antimikotik çözüm durulanır (10X seyreltilir. Kedi hayır 15.240-096; Invitrogen) artı gentamisin (1 mg / ml) 3 ila 5 dakika (aşağıda Şekil 1). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Inkübasyon antibiyotik HBSS veya PBS gibi orta iki kez durulanır sonra. Bir anda göz dünya Sylgard-184 (TEFE) ile kaplı 10 cm Petri kabı aktarılır ve 27G iğne ile güvence altına alınmıştır. K seçik SidePort bıçak kullanma (Alcon) sklerasına siliyer cisim (ön yüzey göz ekvator mesafenin 1 / 3) altında bir kesi ile yapılır. Bu kesi ön göz kısmının çıkarılması için dairesel kesim başlatmak için kullanılır. Bu kesim, bir bıçak tırtıllı (FST) ile bir tungsten-karbür kaplı kavisli iris makası kullanılarak yapılır. Gözün ön kısmının kaldırılması için önce, bir kesim r koparmasını önlemek için vitreus ile yapılırarka kutbunda RPE etina. 5% 40-60 dakika süreyle serum içeren orta gözün ön kısmı çıkarıldıktan sonra, arka kutupta dispase-I çözeltisi (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN. 2 U / ml, kedi hayır 04942086001) ile inkübe edilir 37 ° C-% 5 CO 2. Dispase tedaviden sonra, posterior direkleri silikon dolgu (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) Petri kapları bir HBSS aktarılır ve kadran veya dokuların yeterince düzleştirmek için büyük parçalar halinde disseke. Daha sonra retinanın forseps ile yavaşça kaldırılır. Tek hücreli RPE katmanları sayfaları sıyrılır ve soğuk tripsin-EDTA (Gibco, # 25.200-056) çözümü doğrudan toplanmıştır. RPE toplandıktan sonra, tripsin-EDTA doku tüpler 37 mühürlü ve 10-15 dakika su banyosunda aktarılır ° C Inkübasyon 10 dakika sonra, küçük kümeler halinde RPE ayrı tüpler şiddetle sarsıldı. Mesafeyi tam değilse, tüpler 5 dakika su banyosu içine yerleştirilmiştir. Tripsin-EDTA inkübasyondan sonra, tüpler mümkün un çözünmüş karışık hücre kümeleri için denetlenmektedir. Herhangi bir gözlenen kümeleri ince uçlu cam Pasteur pipeti kullanarak kaldırılır. Aşağı iplik (4 dakika için 1.4 klinik santrifüj rpm) sonra, hfRPE hücrelerin% 15 RPE medyada yeniden askıya alınır ve daha sonra (örneğin primaria şişeler içine koyun: kedi hayır 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA. .) Bu orta,% 5 serum içeren RPE orta ile 1 gün sonra değiştirilir ve 2 ila 3 günde bir sonraki değişiklikler yapılmıştır. 3 ila 4 hafta sonra, hücreler belirsiz ve düzgün pigmentli oldu. Corning Costar Daha sonra% 15 serum içeren RPE hücre kültür ortamı yeniden askıya alınmış ve ortalama 150 200K hücreleri (transwell açık hücre kültürü ekler üzerine numaralı seribaşı, 10 ila 15 dakika boyunca% 0.25 &#39;lik tripsin-EDTA tripsinize. kedi hayır 07-200-161 Fisher Scientific): 12 mm çap ekler, 0.4-um gözenekleri, polyester membranlar (örneğin kullanarak Corning, NY). Tohumlama önce, kuyulardan insan ekstrasellüler matriks (ortalama iyi 150 mcL HBSS 10 mikrogram, kedi hayır 354.237, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ile kaplandı ve 2 saat boyunca başlık UV ışık ile tedavi. Bazı durumlarda, trypsinization prosedürü ilk trypsinization sonra ayırmak vermedi hücreleri toplamak için, ikinci kez tekrarlandı. Aynı protokolü (ECM ile kaplama hariç), matara, hücre P1 nüfus oluşturmak için kültür hücreleri kullanıldı. Bu hücreler ≥ 200 Ω • cm 2 olmak üzere toplam doku direnci vardı ve düzgün pigmentli deneylerde kullanıldı. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Daha büyük bir şekil 1 için buraya tıklayınız</a> . 4. Adım Adım Prosedürleri <ol><li> Birden fazla çözümleri (4 kuyu ihtiyaç duyulan her gözün) ile 12-plaka hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> 1 / göz - 10x antibiyotik antimikotik çözüm eklemek </li><li> PBS / HBSS durulama için bir çözüm eklemek - 2 kuyuları / göz </li><li> dispase çözüm - 1 / göz </li></ol></li><li> Petri kabı 5 fiksasyon iğneler açma ve HBSS ile doldurma diseksiyon hazırlayın </li><li> Paketinden çıkarın gözleri ve 3-5 dakika (adım 1 hazırlanan) antibiyotik antimikotik çözüm içine yerleştirin </li><li> Iki kuyu (adım 1 hazırlanan) PBS / HBSS ile yıkayınız, daha sonra çanak diseksiyon aktarabilirsiniz. </li><li> Trim aşırı kas ve göz çevresindeki bağ dokuları </li><li> Güvenli 27G iğneler (silikon taban aşağı pin) gözleri korneanın yukarı bakacak şekilde hizalayarak çanak diseksiyon kullanma. </li><li> Dairesel kesme başlayacak SidePort bıçak kullanarak, kornea altında kesi yapmak </li><li> Kullanarak iris makası, göz etrafında vitreus üzerinden kesilmiş ve gözün ön kısmını kaldırın sonra aynı makas kullanarak kesin. Not: 3 ile 8 adımda göz küresinin herhangi bir aşırı mekanik basınç önlemek. </li><li> (Adım 1 hazırlanan) dispase çözüm Transfer açık göz </li><li> 37, 40-60 dakika süreyle göz fincan inkübe ° C ile% 5 CO 2 </li><li> Taze bir çanak diseksiyon HBSS çözüm değiştirin. </li><li> Dispase çözüm diseksiyon çanak göz aktarın. </li><li> Konum Petri kabındaki göz (göz küresinin fincan yukarı bakacak şekilde) ve iki 27G iğne ile güvenli. </li><li> Yavaşça kaldırın ve kısmen ayrılmış retina retina makas kullanarak optik sinir uzak retina kesti. Retinanın atın. </li><li> Iris makası kullanarak, optik sinir doğru göz çevreden bir kesi yapmak. </li><li> Tüm beş 27G iğneler kullanarak güzel gergin göz yapma RPE düzleştirmek. </li><li> Retina makas kullanarak optik sinir bağlılık RPE ayıran optik sinir etrafında dairesel kesim olun. Not: 13-17 adımları düşük büyütme ya da stereo mikroskop olmadan yapılabilir </li><li> 250x büyütme stereomikroskopta ayarlayın.veya daha fazla ve iris makas tarafından yapılan kesim birlikte optik sinir yakın RPE sayfasının kenarına bulmak. </li><li> Koroidal doku tabakası ayrı RPE-Bruch membran iki forseps kullanma. Kenarı boyunca RPE ve koroid bağlantı zayıf olduğu alanı bulmak için birkaç girişim gerekebilir. </li><li> Yeri RPE yaprak soğuk tripsin-EDTA çözeltisi içine 15 ml tüp </li><li> 37 RPE 10-15mins tripsin-EDTA su banyosu içine dokuları ile, şapka ve transfer borular toplandıktan sonra ° C </li><li> 10 dakika inkübasyondan sonra, şiddetle, küçük kümeler halinde RPE ayırmak için 15 ml tüpler sallayın. Mesafeyi tam değilse, başka bir 5 dakika su banyosunda geri tüpler içine yerleştirin. </li><li> Mümkün un çözünmüş karışık hücre kümeleri için tüpleri kontrol edin. Herhangi bir gözlenen kümeleri ince uçlu cam Pasteur pipeti kullanarak çıkarılmalıdır. </li><li> (4 dakika için 1.4 klinik santrifüj rpm) hfRPE hücreleri aşağı Spin,% 15 RPE medya (9 ml toplam) süpernatant kaldırmak ve yeniden askıya hücreleri </li><li> Primaria şişeler 2 mL taze% 15 RPE medya, ertesi gün (37 ° C,% 5 CO 2) kadar kuvöz içine balon içine 3 ml hücre süspansiyonu koyun </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Fonksiyonel doğrulama hfRPE hücre kültürü Daha önceki deneylerde, plazma membran transport proteinleri ifade, kutuplaşma ve işlevini belirlemek ve uygulanabilir özellikleri ayarlanan bir doğrulama sağlamak birikmiş olarak RPE fonksiyonu 1-11 Bu özellikler düzenleyen özel sinyalizasyon yollar tanımlamak için bu primer kültürlerinde var her hücre nesil. Transepitelyal sıvı taşıma ve paracellular yolun bütünlüğünü belirleyen proteinleri tespit deneyler aşağıda özetlenmiştir. Bu in vitro deneylerde retina yeniden yatıştırıldı 6 bir hayvan modelinde onaylanmıştır . <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. HfRPE hücreleri CFTR Yerelleştirme Sol üst paneli: CFTR hfRPE hücrelerin membran zenginleştirilmiş özler kullanılarak tespit edildi. M, moleküler ağırlık belirteci; şeritli 1, Merkezi alt panelde büyük olgun (bant C) ve immatür (A ve B grupları): CFTR immünofloresan lokalizasyonu (yeşil etiket) Top sağ panelde gösteren z düzlemi boyunca büyük kesit görünümü. z-ekseni üzerinden maksimum yoğunluk projeksiyon. ZO-1 (kırmızı olarak işaretlenmiş) RPE apikal ve bazolateral tarafı tasvir sıkı bir bağlantı belirteci olarak hizmet vermektedir. DAPI (mavi), bazal membran bulunan çekirdeklerin yakın etiketler. ZO-1 CFTR kırmızı etiket örtüşmektedir yeşil floresan bu yana, sarı / turuncu olarak görünür. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. HfRPE içinde IFNγ indüklenen fizyolojik değişiklikler A: bazal banyo IFNγ Ayrıca, ilköğretim, kültürlü hfRPE hücrelerin tek tabaka üzerinde transepitelyal sıvı taşımacılığı (J v) artmış J v üst izlemesi zaman fonksiyonu ve net sıvı olarak çizilir . emme (bazal banyo için apikal) pozitif değerler ile gösterilir; transepitelyal potansiyeli (TEP) ve total doku direnci (R T) alt izleri zamanın bir fonksiyonu olarak çizilir. B: bazal banyo CFTRinh-172 (5 mcM) eklenmesi IFNγ uyarılmış J v artması engellenir. Aşağıda hayvan modeli deneyler vitro bulgular hfRPE doğrulayan bir örnektir. Bu deneyde, yapay olarak oluşturulmuş retina dekolmanı (Şekil 4 A, B) dış göz yüzeyine IFNg eklenmesinden sonra önemli ölçüde azalmıştır. Bu etki kısmen tarafından bloke edilebilir: (1) Ayrıca cAMP bloker (Şekil 4D), (2) JAK + cAMP blokerler eklenmesinden sonra tamamen engellendi. Aşağıdaki resimlere Ekim tarayıcı kullanılarak elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4, in vivo retina dekolmanı deneylerde in vivo deneylerde bu prosedürleri daha önce ayrıntılı 6 tarif edilmiştir . Bu deneylerde, retina dekolmanları subretinal boşluk (SRS), tek başına ya JAK-STAT ve PKA yolak inhibitörleri kombinasyonu ile modifiye PBS çözüm 0,5-3 mcL enjeksiyon yoluyla sıçan göz yaratıldı. Her deneyde, retina dekolmanı oluşturulmasından sonra, 40-70 dk bir başlangıç ​​kontrolü süre vardı. Bu süre zarfında, bleb hacminin değişim oranı bleb istikrar sigorta ölçüldü. Optik koherens tomografi görüntüleme (Uygulamalı Fizik Enstitüsü, Rusya Bilimler Akademisi, Nizhniy Novgorod, Rusya) SRS ses düzeyini değiştirmek zaman ders ölçmek için kullanılmıştır. Re-eki vol zaman kursuume değişiklik Optik Koherens Tomografi (OCT) ile ölçüldü. Dekolmanı boyutlarda bir değişim göstermektedir (A, B, oklar, ve D) 40-70 dakika süreyle ön yüzeyine IFNγ Ayrıca aşağıdaki 4 farklı deneyler (AD soldaki paneller) OCT görüntüleri. Paneller A ve IFNγ kontrol oranı JV arttığını B gösterisi (≈ 2 ul • 2 • saat -1) sırasıyla 14 ve 12 ul • cm 2 saat-1 cm. Kaynaklı emme oranları önemli ölçüde JAK-STAT yolu ve PKA inhibitörleri (C ve D), IFNγ ilavesinden sonra 0.2 ve 7.9 azaldı ul • cm 2 • saat-1, sırasıyla. Oklar, kesikli çizgi içine alan, (başlangıç ​​hacim) ile karşılaştırıldığında bleb sınırını gösterir. Figürün sağ tarafı: t = 0 dekolmanı mekansal kapsamı ve çeşitli deneyler Ölçülen JV oranları üst panelde özeti; orta panel film ( <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">buraya tıklayın</a> ); alt panel-3D B. mavi Pseudocolor özetlenebilir deney bölümleri gösterir . INFγ ek 40 dakika sonra. Vizyon Araştırma ve Oftalmoloji bildirimde Derneği ile uyumlu Tüm hayvan deneyleri yapılmıştır. Protokolü Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

<ol>
	<li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+paradigm:+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells.">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell &#38; Melanoma Research. , .</li><li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li><li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+184:+Phototransduction:+RPE+transport+Retina+Phototransduction:+RPE+transport.">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).</li><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+Building+polarized+tissue.">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium.">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li><li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+localization,+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+(JAM-C)+in+human+retinal+pigment+epithelium.">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN{gamma}+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport.">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-C+and+-D+induced+proliferation/migration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines.">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li><li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y(2)+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat.">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li><li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li><li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling,+ion,+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li><li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R)-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage.">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li></ol>

Mevcut deneylerde, göz başına elde edilen hücrelerin daha yüksek bir numaraları ile tutarlı hfRPE primer kültürlerinde üretmek için gerekli çoklu adımları kolaylaştırmak için tasarlanmış, daha önce yayınlanan teknikler 3 ek değişiklikler açıklanmaktadır. Orijinal prosedür her değişiklik, titizlikle değişiklikler eserleri tanıtmak etmedi ve sürekli olarak bu hücreleri kullanarak birçok diğer laboratuvarlar tarafından test edilen sağlamak için birden fazla fizyoloji ve moleküler biyoloji deneyleri test edildi. Son olarak, ek deneyler, hayvan modellerinde in vitro sonuçlar benzer tedirginlikler karşılaştırmak için yapılmıştır .

Diseksiyonu protokol için gerekli Aletleri <ol><li> Stereo Mikroskop - diseksiyon için gerekli çalışma büyütme x250 ile herhangi bir </li><li> Diseksiyon çanak - örneğin Kimble 100 x 20mm # 23062 (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Sylgard 184 - TEFE Kedi. # SYLG184 * * Çanak Sylgard 184 karıştırma talimatları takip diseksiyon hazırlamak için, 5-8mm tabaka oluşturur karışık sıvı elastomer Petri kabı içine dökün. Elastomer en az 24 saat için tedavi etmek için izin ver. Tedavi elastomer Bulaşık% 70 etanol ve tekrar birden çok kez (~ 100 kat) ile sterilize edilebilir </li><li> 27 G iğne BD PrecissionGlide 1 ¼ uzunluğu (diseksiyon başına 5) herhangi bir kaynaktan </li><li> Ca ve Mg tuzları içeren HBSS 1X Çözüm - Gibco Kedi # 14025 500ml (çok diseksiyonlarının iyi). </li><li> Iris makas karbür tırtıklı bıçağı, kavisli - FST Kedi # 14.559-11 (bir). </li><li> Retina makas - Katena Kedi # K4-5300 (bir). </li><li> Forseps - örneğin Dumont Cımbız # 5 TEFE Cat cilalı ipuçları # 500.085 (2 adet). </li><li> Bıçak SidePort - Alcon, k seçik 1mm, Çift Konik, açılı Kedi # 8065921540. </li><li> Tüp 15ml Santrifüj (bir göz için) herhangi bir kaynaktan </li><li> Pasteur, cam pipet (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Plaka iyi 12 (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Primaria 25cm 2 balon - (göz için 2-3) herhangi bir kaynaktan </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

Biz yerli insan RPE morfolojik, fizyolojik ve genetik özellikleri ile birincil insan fetal retina pigment epitel (hfRPE) kültürler konfluent mono tabakaları büyük miktarlarda üretebilir bir hücre kültürü prosedürü geliştirdik. Bu hfRPE hücre kültürleri ağır pigmentasyon sergi ve elektron mikroskobu geniş apikal membran mikrovilluslar göstermektedir. Junctional kompleksleri çeşitli sıkı kavşak proteinlerin immünofloresan etiketlenmesi ile tespit edildi. Bu kolayca tekrarlanabilir birincil kültürlerin Epitel polarite ve fonksiyon yakından Daha önce insan dahil olmak üzere yerli RPE memeli modelleri, çalışılan benzerler. Bu sonuçlar, birçok hayvan modellerinde insan göz hastalığı tedavi edici girişimlerin geliştirilmesi ile uzatıldı. Biz, retina veya subretinal alan anormal sıvı birikimi kaldırılması için stratejiler üzerinde duruldu. Ekstrasellüler subretinal alan fotoreseptör dış segmentleri ve RPE apikal membran ayırır ve retina ekleri bakım ve RPE / retinanın etkileşimi bir bütün ana için kritik öneme sahiptir.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology at JoVE.com

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.2K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Video: Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Genetik

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain the overall health and structural integrity of the photoreceptors. The RPE is polarized, exhibiting apically and basally located receptors or channels, and performs vectoral transport of water, ions, metabolites, and secretes several cytokines.
In vivo noninvasive measurements of RPE function can be made using direct-coupled ERGs (DC-ERGs). The methodology behind the DC-ERG was pioneered by Marmorstein, Peachey, and colleagues using a custom-built stimulation recording system and later demonstrated using a commercially available system. The DC-ERG technique uses glass capillaries filled with Hank&#8217;s buffered salt solution (HBSS) to measure the slower electrical responses of the RPE elicited from light-evoked concentration changes in the subretinal space due to photoreceptor activity. The prolonged light stimulus and length of the DC-ERG recording make it vulnerable to drift and noise resulting in a low yield of useable recordings. Here, we present a fast, reliable method for improving the stability of the recordings while reducing noise by using vacuum pressure to reduce/eliminate bubbles that result from outgassing of the HBSS and electrode holder. Additionally, power line artifacts are attenuated using a voltage regulator/power conditioner. We include the necessary light stimulation protocols for a commercially available ERG system as well as scripts for analysis of the DC-ERG components: c-wave, fast oscillation, light peak, and off response. Due to the improved ease of recordings and rapid analysis workflow, this simplified protocol is particularly useful in measuring age-related changes in RPE function, disease progression, and in the assessment of pharmacological intervention.

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Here, we present a method for recording light-evoked electrical responses of the retinal pigment epithelium (RPE) in mice using a technique known as DC-ERGs first described by Marmorstein, Peachey, and colleagues in the early 2000s.

Mouse Retinal Pigment Epitelinin Işık Uyarılmış Elektriksel Tepkilerini Kaydetmek için Doğrudan Birleştirilmiş Elektroretinogram (DC-ERG)

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

Kimya

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Dejeneratif Retina Hastalıkları için İnsan Dışı Primat Modelinde Retina Pigment Epitel Transplantasyonu

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Tıp

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Biyoloji

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

Retina Dejenerasyonunun Modellenmesi ve Analizi

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Yazar Spotlight: Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Patogenezini Çözmek ve Potansiyel Tedavileri Keşfetmek 

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

LipidUNet-Machine Learning Tabanlı iPSC Kaynaklı Retinal Pigment Epiteli Kullanılarak Lipid Birikintilerinin Karakterizasyonu ve Nicelleştirilmesi Yöntemi