Это исследование направлено на получение информации о белках без меток на уровне одной молекулы в режиме реального времени, уделяя особое внимание белкам, которые сложно исследовать с помощью современных методов или которые имеют отношение к заболеванию. Плазмонные нанопинцеты недавно продемонстрировали свою способность контролировать конформационную динамику при связывании с малыми молекулами, проверять кинетику разборки и выяснять ландшафты свободной энергии на уровне отдельных молекул. В настоящее время ни один из установленных методов характеризации белков не способен исследовать конформационную динамику одномолекулярных белков без меток.
Считается, что плазмонные нанопинцеты обладают потенциалом для заполнения этой ниши в этой области. Это уникальное преимущество помогает нам исследовать взаимосвязь между конформационными изменениями белков и их биологическими функциями, а также их влиянием на развитие заболеваний. Будущие исследования будут сосредоточены на внутренне неупорядоченных и мембранных белках, поскольку многие из них участвуют в нескольких заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и различные виды рака.
Для начала поместите образец с покрытием из ПЭГ-тиола в напечатанную на 3D-принтере проточную ячейку с помощью прямого пинцета, следя за тем, чтобы слой золота был обращен вверх. Снимите с одной стороны крышку прозрачного двустороннего скотча из прозрачного ПЭТ-пластика. Осторожно наклейте ленту на образец и проточную ячейку, следя за тем, чтобы наноструктуры и впускные/выпускные отверстия в проточной ячейке оставались открытыми.
С помощью закругленного пинцета аккуратно прижмите края ленты, чтобы обеспечить ее сцепление с проточной ячейкой и образцом. Снимите с другой стороны ленту и аккуратно наденьте на образец стеклянную крышку. С помощью закругленного пинцета прижмите края защитного клинка, чтобы обеспечить его адгезию.
В результате этого процесса создается жидкостный канал внутри проточной ячейки высотой 50 микрометров и объемом 3,5 микролитра. С помощью небольшого наконечника для пипетки смешайте равные части раствора А и раствора Б дублирующего силикона на предметном стекле микроскопа в соотношении один к одному или указанном производителем. Заполните зазоры между покровным стеклом и проточной ячейкой смешанным дублирующим силиконом, аккуратно продавливая его под покровное стекло.
Держите проточную ячейку вверх дном и аккуратно нанесите дублирующийся силикон вокруг внутренней стенки отверстия. Осторожно переместите силикон на видимые края плавленого диоксида кремния на нижней стороне образца, оставив образец сохнуть золотым слоем вверх, пока дублирующий силикон полностью не схватится. Убедившись, что все компоненты подключены правильно, загрузите пользовательский интерфейс микрофлюидной системы на компьютер.
Нажмите на значок воспроизведения рядом с распределителем мультиплексора и проводом, которые управляют 12 поворотным клапаном и тремя двухходовыми клапанами соответственно, чтобы открыть их соответствующие интерфейсы. Чтобы обойти трехходовой двухходовой клапан, включите порт первого провода. Чтобы установить проточную ячейку в плазмонный пинотвец, прикрепите входную и выходную трубки к соответствующим частям проточной ячейки.
Поместите проточную ячейку на чистую ткань золотым слоем вверх. Вливайте буфер в проточную ячейку с высокой скоростью потока примерно 0,3 миллилитра в минуту. Убедитесь, что жидкость движется по образцу внутри проточной ячейки и что жидкость не видна ни снаружи, ни снизу.
Нанесите одну-две капли иммерсионного масла на объектив 100X. Поместите проточную ячейку в столик плазмонного нанопинцета золотым слоем вниз. Закрепите проточную ячейку с помощью металлических зажимов на магнитах и зафиксируйте предметный столик, чтобы удержать его на месте.
Включите источник белого света. Откройте программное обеспечение камеры и отрегулируйте время экспозиции и усиление, пока наноструктуры не станут видимыми. Включите лазер на относительно высокой мощности и вручную отрегулируйте ось Z, пока лазерное пятно не станет видимым.
Включите пьезоэлектрический контроллер и выберите соответствующие настройки коммуникационного порта и максимального напряжения. Установите значения по осям X, Y и Z на половину максимального напряжения, чтобы обеспечить лучшее выравнивание столика во всех направлениях. Совместите лазерное пятно с одним из двойных наноотверстий или структур DNH с помощью ручек управления по осям X, Y и Z главного стола.
Убедитесь, что лавинный фотодиод или APD включены. Аккуратно закройте корпус плазмонным пинотвизетом. Откройте программное обеспечение, связанное с записью APD, например самодельный пользовательский интерфейс LabVIEW. Отредактируйте имя файла и установите частоту среза равной одному килогерцу.
Затем укажите желаемый путь к файлам, куда будут сохраняться файлы. Выключите источник белого света и снова включите лазер. После установки мощности лазера на соответствующий уровень с помощью пьезоэлектрических регуляторов отрегулируйте оси X, Y и Z до тех пор, пока сигнал APD не станет максимально высоким.
Избегая насыщения APD и с минимальным стандартным отклонением трассы. Затем выключите лазер, чтобы продлить срок службы наноструктур. Запустите блок управления шприцевым насосом и пользовательский интерфейс распределителя, чтобы установить клапан и извлечь нужное количество белка.
Используя микрофлюидный пользовательский интерфейс, вливайте белковый раствор со скоростью, аналогичной скорости вывода. Продолжайте инфузию с такой скоростью до тех пор, пока белковый раствор не достигнет проточной ячейки. Затем установите скорость потока на соответствующее значение для улавливания и дождитесь стабилизации кривой.
Убедитесь, что объем и время работы шприцевого насоса соответствуют ожидаемым значениям. Чтобы записать данные сигнала APD, отрегулируйте оси X, Y и Z по мере необходимости с помощью пользовательского интерфейса пьезоэлектрического контроллера. Заметив большое изменение в пропускании и стандартное отклонение, запишите время, которое это произойдет, для будущей сортировки данных. Если белок необходимо высвободить в рамках эксперимента, выключите лазер примерно на пять секунд, а затем включите его снова.
Трасса должна иметь большое изменение пропускания и значительно более низкое стандартное отклонение, указывающее на возврат к исходному состоянию. После завершения эксперимента выключите лазер. Снимите проточную ячейку с трехосевой ступени и отсоедините трубку микрожидкостной системы.
Поместите проточную ячейку на чистую ткань золотым слоем вверх. С помощью скальпеля осторожно разрежьте клей под стеклозащитным листом, прежде чем аккуратно снять его и утилизировать. Держите проточную ячейку под углом так, чтобы золотой слой все еще был обращен вверх, и с помощью закругленного пинцета осторожно удалите клей с нижней стороны проточной ячейки, чтобы освободить образец.
С помощью прямого пинцета возьмите образец и тщательно промойте его изопропанолом. Высушите образец с помощью пневматического пистолета. Репрезентативный эксперимент, проведенный по нагрузке железа in-situ на молекулу апоферритина, демонстрирует использование плазмонного нанопинцета в качестве инструмента для исследования конформационной динамики белков.
След передачи апоферритина остается стабильным при попадании в раствор PBS, что указывает на отсутствие существенных конформационных изменений. При воздействии на раствор черных металлов колебания стандартных отклонений следа увеличивались, что свидетельствовало о динамических структурных изменениях, связанных с нагрузкой на железо. После 20 минут воздействия железа след пропускания стабилизировался, что свидетельствовало о переходе апоферритина в его голоформу.
Графики функции плотности вероятности продемонстрировали сдвиг в распределении напряжения при нагрузке на железо, что еще больше подтверждает конформационный переход от апоферритина к холоферритину.
