Основное внимание в моем исследовании уделяется получению критически важной подтверждающей информации о бета-амилоиде 1-40, когда он поглощается поверхностью наночастиц золота и происходит обратимый процесс агрегации. Задача, стоящая перед нами в этой области исследований, заключается в получении тепловой, химической и динамической информации о процессе обратной агрегации. Важным открытием этого проекта является то, что мы можем идентифицировать конкретное движение или режим вибрации, способствующий свернутому или развернутому подтверждению бета-амилоида 1-40, когда они поглощаются на поверхности наночастиц золота.
Большим преимуществом использования SERS, спектроскопии комбинационного рассеяния с поверхностным усилением, является обнаружение очень малых, слабых сигналов рассеяния для определения моды, которая имеет решающее значение для возникновения сворачивания и развертывания. В то же время мы можем точно определить морфологию агрегатов. Результаты, которые мы можем получить в результате этого проекта, являются ключевым взаимодействием белок-белкового взаимодействия, которое будет иметь важное значение для возникновения олигомера и которое приведет к фиброгенезу.
Для начала с помощью микропипетки добавьте один миллилитр дистиллированной деионизированной воды к одному миллиграму бета-лиофилизированного амилоида, или бета-амилоида А 1-40. Перемешайте раствор с помощью вихревого миксера в течение примерно 30 секунд. Убедитесь, что в растворе не осталось твердых частиц при комнатной температуре, примерно 20 градусов Цельсия.
Далее приготовьте пептидные стоковые растворы с использованием деионизированной и дистиллированной воды. Определите концентрацию пептида путем спектроскопического измерения поглощения тирозина на глубине 275 нанометров. Храните стоковые растворы A beta 1-40 при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Разморозьте пептидный исходный раствор примерно за пять минут до сбора данных. В 15-миллилитровой центрифужной пробирке смешайте восемь микролитров раствора пептида с 800 микролитрами коллоидных частиц золота. Добавьте 4,2 миллилитра деионизированной дистиллированной воды, затем сделайте образец вихревым в течение 10 секунд.
Зафиксировать концентрацию пептидов A beta 1-40 на уровне 1,8 наномоляра и отрегулировать соотношение пептидов к коллоидным частицам золота в определенном диапазоне. С помощью блока контроля температуры УФ-видимого спектрофотометра установите температуру раствора при комнатной температуре, примерно 22 градуса Цельсия. Контролируйте начальный pH раствора образца с помощью pH-метра и отрегулируйте его до уровня чуть ниже pH 7.
Собирайте спектр поглощения в диапазоне от 400 до 800 нанометров. Затем отрегулируйте pH образца примерно до pH четыре, добавив 1,0 микролитра молярной соляной кислоты. Собирайте спектр поглощения в том же диапазоне от 400 до 800 нанометров.
Затем отрегулируйте pH образца примерно до pH 10, добавив примерно 1,5 микролитра 1,0 молярного гидроксида натрия. Сбор спектра поглощения в том же диапазоне длин волн от 400 до 800 нанометров. После этого измените pH от pH 4 до pH 10 10 раз, добавив либо соляную кислоту, либо гидроксид натрия.
Непрерывно собирайте спектр поглощения при температуре 25 градусов Цельсия. Получение набора данных ASCII о длинах волн в зависимости от поглощения. Используйте программу PeakFit для извлечения средних положений вершин полосы.
Используя функцию графика, постройте график набора данных, чтобы визуализировать оптическую плотность в зависимости от длины волны. Определите и отметьте начальные пиковые длины волн, лямбду 1 и лямбду 2, выбрав их приблизительное положение на построенных графиках. Подгонка данных осуществляется с помощью функции пиковой аппроксимации исходной программы.
Получите график, отображающий центральные положения пиков для каждой лямбды, обозначенной как XCI, вместе с соответствующими областями канала, обозначенными как AI. Экспортируйте извлеченные положения вершин и соответствующие области в программу для анализа электронных таблиц. Рассчитайте весовой коэффициент, AI, для каждого центра пика, сравнив площадь полосы с общей площадью всех полос по отображаемой формуле. Затем извлеките среднее положение пика с помощью уравнения, отображаемого на экране.
Чтобы построить график обратимости, сведите в таблицу средние положения пиков в зависимости от номера операции N. Присвойте номер операции N, как указано на экране. Проанализируем положение пика в точке N с помощью выведенной формулы. Перенесите рассчитанный набор данных в исходное программное обеспечение и постройте его на график.
Выберите нелинейную аппроксимацию кривой анализа, введите начальные значения для A, B, C, D и E и нажмите кнопку "Выполнить", чтобы завершить процесс аппроксимации кривой. Для выполнения комбинационной визуализации для каждого образца под номером операции N необходимо поместить 100 микролитров раствора на слюдяной диск диаметром один сантиметр. Перед измерением дайте образцам высохнуть в течение ночи.
Затем соберите изображения в белом свете для каждой операции под номером N. Подготовьте отдельный образец на новом слюдяном диске, так как pH постоянно изменяется в диапазоне от 4 до 10. Соберем рамановское изображение для каждого номера операции, причем с использованием упомянутых спецификаций лазера с длиной волны 633 нанометра. Захватывайте изображения в сетке 100 на 100 пикселей с определенным временем интегрирования, фокусируясь на нужной области спектра.
Постройте репрезентативный спектр для каждой операции с числом N, выровненный как функция N.Постройте трехмерную спектроскопию комбинационного рассеяния света с усиленной поверхностью, или спектр SERS, как функцию N для 20-нанометрового золота с покрытием A beta 1-40. Используйте вид спектра сверху в качестве контурной карты для выделения конкретных мод, связанных с определенным состоянием pH. Идентификация спектральных особенностей с улучшением только при четных или нечетных числах операций.
Полоса SPR наночастиц золота с покрытием A beta 1-40 сместилась с 530 нанометров до примерно 650 нанометров, когда раствор стал более кислым. Это соответствовало образованию коллоидных агрегатов золота с развернутыми мономерами бета-1-40 А, наблюдаемым методом ПЭМ. Также было очевидно pH-зависимое изменение цвета золота с покрытием A beta 1-40.
Обратимый pH-зависимый сдвиг средней полосы достиг пика между более короткой и длинной длиной волны, а чередование дисперсной и агрегатной морфологии, наблюдаемое в ПЭМ, подтвердило квазиобратимый характер процесса. Визуализация в белом свете показала четкую обратимую картину агрегации, соответствующую сдвигам pH, в то время как спектры SERS показали тонкие pH-зависимые изменения в области отпечатков пальцев.
