Наша команда изучает метаболические, сердечные, мышечные расстройства сна и старение с использованием модели дрозофилы. В этой статье Юпитера подробно описан упрощенный протокол обработки тканей мозга, включая обезглавливание, фиксацию, криосекцию, окрашивание и визуализацию. Моя исследовательская группа была пионером в разработке модели дрозофилы для изучения нескольких заболеваний и старения человека.
Мы также исследовали такие вмешательства, как ограниченное по времени питание и физические упражнения. Мы используем машинное обучение, омику и молекулярный подход для изучения таких факторов, как циркадный ритм и генетика, чтобы выявить их влияние на клеточную целостность, физиологию и поведение. Этот упрощенный протокол исследования мозга дрозофилы позволяет избежать сложных вскрытий, требует выполнения только одной рукой и устраняет необходимость в дорогостоящей конфокальной микроскопии, повышая доступность и снижая зависимость от оборудования.
Для начала заведите мух во флаконах для старения, затем откройте клапан на коврике с углекислым газом и быстро сбросьте мух на коврик, чтобы предотвратить побег. Как только мухи потеряют сознание, поместите их под микроскоп SZ61, переместив коврик под линзу объектива. Регулируйте увеличение и фокусируйтесь до тех пор, пока мухи не станут хорошо заметны и их будет удобно обезглавить.
Используя пружинные ножницы, расположите лезвия между грудной клеткой и головой мухи и сильно сожмите, чтобы обезглавить от пяти до 10 голов мухи на экспериментальную группу. Поместите любых и использованных мушек обратно в их стареющую пробирку. С помощью щетки аккуратно переложите обезглавленные головки мух в промаркированные пробирки объемом 1,5 миллилитра, помещенные на лед.
После извлечения пробирок изо льда нанесите пипеткой 100 микролитров 4%-ного параформальдегида и PBS в каждую пробирку, убедившись, что все головки мух полностью погружены в воду. Если головки прилипают к стенкам трубки, осторожно надавите на них вниз с помощью щетки или слегка постучите трубкой по горизонтальной поверхности, чтобы обеспечить надлежащий контакт с раствором. Затем инкубируйте пробирки в течение 15 минут на орбитальном вибростенде при средней настройке.
Выбросьте раствор параформальдегида и замените его PBS, убедившись, что все головки мух погружены в воду. После окончательной промывки переложите головки мух в 10% раствор сахарозы в PBS, убедившись, что они погружены в трубку. Заполните маркированную форму примерно на 50% производительностью с оптимальной температурой резки или составом OCT, чтобы он распределился по всем четырем углам формы.
С помощью щетки осторожно поместите собранные неподвижные головки мух на поверхность ОКТ-пластика внутри формы. С помощью кончика щипцов осторожно прижмите каждую головку к дну формы, следя за тем, чтобы глаза были ориентированы вниз для разреза в корональной плоскости. Тщательно выровняйте все головки в размерах X, Y и Z, чтобы убедиться, что все секции будут содержать все экспериментальные группы одновременно.
После правильного выравнивания головок аккуратно поместите формы прямо в морозильную камеру, установленную при температуре минус 20 градусов Цельсия для заморозки. Как только форма в основном замерзнет, заполните оставшееся пространство составом OCT. Для криосекции формы нанесите большое количество ОКТ-компаунда на верхнюю часть формы, чтобы прикрепить биту патрона к форме.
Положите биту сверху и дайте ей полностью застыть внутри криостата, что обычно занимает пять минут. Затем извлеките биту и блок OCT из формы. Поместите блок в патрон, обеспечив правильную ориентацию сверху вниз, и затяните ключ патрона до тех пор, пока блок не будет надежно зафиксирован на месте.
С помощью ручек регулировки и регуляторов глубины патрона совместите блок с лезвием. Установите ширину сечения на криостате на 20 микрометров и разрежьте каждый ломтик медленным последовательным движением, позволяя стеклу с защитой от скручивания захватить каждый кусочек. Затем запечатлейте секции с помощью теплых слайдов, прикоснувшись слайдом к ближнему краю секции и позволив секции подняться на слайд.
Дайте предметным стеклам высохнуть при комнатной температуре не менее 30 минут, но не более одного часа. Возьмите криосекционные головы мухи дрозофилы и с помощью бритвенного лезвия удалите остатки ОКТ-соединения по краям предметного стекла, оставив место для гидрофобной границы. Затем с помощью гидрофобного маркера нарисуйте границу вокруг каждого слайда и дайте ему высохнуть в течение пяти минут.
Промойте все предметные стекла три раза по пять минут каждый с помощью PBS, аккуратно пипетируя на предметном стекле. После промывки предметных стекол нанесите пипетку 3% BSA в растворе для блокировки триса с использованием физиологического раствора на предметные стекла и инкубируйте от 30 минут до одного часа. Затем выбросьте блокирующий раствор и пипеткой нанесите первичный раствор антитела на предметные стекла.
Инкубируйте антитело в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия или в течение одного часа при комнатной температуре, используя влажные салфетки для предотвращения высыхания. Выбросьте первичный раствор антител и промойте предметные стекла три раза по пять минут каждый с помощью PBS. Затем добавьте вторичный раствор антитела на предметные стекла и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.
После трехкратной промывки горок PBS, оставьте на горке лишь небольшое количество PBS. Затем с помощью пипетки объемом 1000 микролитров равномерно добавьте от трех до пяти капель затвердевающего монтажного материала, содержащего DAPI, по предметному стеклу. Наденьте на предметное стекло крышку, убедившись, что во время установки не образуются пузырьки воздуха.
Осторожно обращайтесь со свежеустановленными предметными стеклами и храните их в горизонтальном положении до полного высыхания монтажного носителя. Если необходимо длительное хранение, запечатайте края горки. Сделайте снимки слайдов как можно скорее, чтобы свести к минимуму затухание флуоресценции.
Во время получения изображений сосредоточьтесь на каждом уникальном объекте в одном и том же канале, чтобы обеспечить согласованность во всех экспериментальных группах. Откалибруйте экспозицию для каждого канала, чтобы избежать передержки во всех выбранных каналах. Убедитесь, что выбранные экспозиции остаются постоянными и подходят для всех субъектов, особенно между различными экспериментальными группами.
Экспрессия метки антител ApoE была четко локализована в областях мозга образцов Elav+ и Elav-ApoE4. На накопление липидов указывало окрашивание в красный цвет Нила, которое было видно в областях мозга у обоих генотипов.
