Скрининг малых молекул и тестирование токсичности личинок данио-рерио на ранних стадиях

Для начала соберите эмбрионы данио-рерио на ранних стадиях через три дня после оплодотворения в чашке Петри. С помощью микропипетки объемом 1000 микролитров, установленной на 100 микролитров, перенесите по одному здоровому на вид вылупившемуся эмбриону в каждую лунку планшета на 96 лунок. Теперь нанесите пипеткой необходимое количество исследуемого химического вещества в каждую лунку 12-луночного планшета.

Затем отрегулируйте общий объем до 2,4 миллилитра со средой Е3. Подготовьте систему управления автомобилем в соответствии с растворителем, используемым для растворения стандартного испытательного химиката. С помощью пипетки объемом 200 микролитров удалите любой существующий раствор E3 из каждой лунки планшета на 96 лунок.

Используйте восьмиканальный микропипетку, чтобы заменить его 100 микролитрами подготовленной исследуемой среды для каждой концентрации. Убедитесь, что в общей сложности проверяется 24 личинки на одну концентрацию. Через 24 часа используйте стереосветовой микроскоп для проведения морфологической оценки.

Оцените морфологию с помощью бинарного метода, где absent указывает на нормальную морфологию, а present указывает на морфологическую аномалию. Когда забивка будет завершена, удалите по 50 микролитров среды из каждой лунки. Замените его 50 микролитрами свежеприготовленной тестовой среды.

Удалите и запишите все мертвые личинки, затем инкубируйте личинок при температуре 28,5 градусов Цельсия с 14-часовым световым и 10-часовым темным циклом. Рыбки данио через пять дней после оплодотворения демонстрировали различные фенотипы после двух дней воздействия препарата. Непораженные рыбы данио наблюдались в норме, в то время как у некоторых рыб наблюдался легкий отек перикарда.

У других отмечен выраженный отек перикарда, сопровождающийся кровотечением из желтка и удлинением желтка. Также наблюдалась задержка развития с уменьшением пигментации, плавательного пузыря и общей длины. Дополнительные фенотипы включали рыбок данио с вздутым желтком и изогнутым хвостовым плавником, отсутствующим хвостовым плавником и изогнутой хордой.

В тяжелых случаях наблюдалось усечение и смерть с некрозом.