Мою группу интересуют механизмы, регулирующие экспрессию генов в нейронных клетках-предшественниках развивающегося неокортекса. В частности, мы сосредоточимся на эпигенетических механизмах. Они важны для способности нейронных клеток-предшественников к пролиферации и дифференцировке, а следовательно, для правильного развития и функционирования мозга.
Корковые органоиды — это захватывающие новые модели, которые позволяют нам изучать развитие человеческого мозга. Они также позволяют нам моделировать развитие других видов приматов. В этом протоколе мы описываем электропорацию органоидов коры головного мозга человека для изучения функции генов.
Органоиды нарезаются с помощью вибратома, что делает их особенно доступными для инъекций и электропорации. Электропорация органоидов коры головного мозга человека представляет собой мощный метод изучения функции генов. Мы использовали этот метод для изучения экспресс-фактора роста приматов EPIREGULIN, который участвует в развитии и эволюции мозга.
Мы также использовали этот метод для изучения активности энхансерных областей у разных видов приматов. Для начала встройте органоиды коры головного мозга человека, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, в агарозу с низкой температурой плавления 3%. Нарежьте органоиды на виброуме на участки толщиной 500 микрометров.
После нарезки продолжайте культивирование органоидов в шестилуночной пластине со сверхнизким уровнем прикрепления, содержащей четыре мозговых среды, три на орбитальном шейке при 120 об/мин. Далее установите микрокапиллярный пуллер на заданные настройки для вытягивания капилляров боросиликатного стекла для инъекций. После вытягивания храните капилляры в большой чашке Петри и закрепите их скотчем.
В день электропорации предварительно подогрейте раствор Tyrode до 37 градусов Цельсия и приготовьте CRISPR Cas9 RNP при конечной концентрации 24 микромоляра. Добавьте плазмиду pCAG-GFP и 0,1% раствор Fast Green в воду в конечную смесь для инъекций. Выберите органоиды коры головного мозга человека с хорошо развитыми желудочковыми структурами и отбросьте органоиды, у которых эти структуры отсутствуют.
Перенесите до 10 органоидов в 6-сантиметровую чашку Петри, содержащую раствор Тирода. С помощью наконечника для пипетки микрозагрузчика заполните стеклянный микрокапилляр 10 микролитрами раствора для инъекций. Откройте капилляр, отщипнув тонкий конец пинцетом.
Проверьте, открыт ли капилляр, выпустив часть инъекционной смеси в раствор Tyrode. Введите капилляр в центр желудочковых структур и нажмите на ножной переключатель микроинъектора, чтобы ввести 0,2-0,5 микролитра смеси. Используйте тонкие щипцы, чтобы протолкнуть органоид, чтобы ограничить его движение, не захватывая его.
После инъекции, используя наконечник пипетки с широким отверстием, перенесите один-два введенных органоида в камеру электропорации, содержащую раствор Тирода. Ориентируйте вводимые органоиды по направлению к электродам, следя за тем, чтобы апикальная радиальная глия и желудочковые области были обращены наружу. Прикрепите кабели к камере электропорации инжектируемой стороной органоида обращенной к положительному полюсу.
Нажмите кнопку Pulse на электропораторе, чтобы подать пять импульсов напряжением 38 вольт в течение 50 миллисекунд каждый с интервалом в 1 секунду. После электропорации верните органоиды коры головного мозга человека в четыре среды мозга и культивируйте их без встряхивания в течение 24 часов. После фиксации и криоссекции электропорированных корковых органоидов человека проводят забор антигена в цитратном буфере в течение одного часа при температуре 70 градусов Цельсия на водяной бане для иммуногистохимического анализа.
Промойте срезы один раз в PBS в течение пяти минут. Затем коротко просушите слайды и с помощью восковой ручки обведите секции. Срезы гасить с помощью 0,1 молярного глицина в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем дважды промойте секции PBS по пять минут каждая. Добавьте блокирующий буфер на секции и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте секцию в первичных антителах в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.
На следующий день промойте секции три раза PBS по пять минут каждый. Инкубируйте срезы со вторичными антителами и DAPI в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре. После промывки среза PBS установите предметное стекло с монтажным материалом и сделайте снимки срезов с помощью флуоресцентного микроскопа.
Иммуногистохимия электропорированных органоидов выявила множественные целевые желудочки в электропорированном кортикальном органоиде с оптимальными электропорациями, нацеленными на желудочковые структуры, расположенные во внешних областях органоида. Устранение неполадок необходимо, если наблюдается чрезмерная гибель клеток. Это может быть вызвано высокой концентрацией плазмид или неоптимальными настройками электропорации.
Электропорации, обращенные внутрь органоида, часто труднее интерпретировать из-за того, что кортикальные пластинчатые области сливаются с соседними желудочками. Нарушение апикальной поверхности может произойти при применении чрезмерного объема инъекции или сильных электрических импульсов, что приводит к разрыву желудочков и расслоению клеток. Нокаут белка репрессивного комплекса Polycomb 1 PCGF4 был подтвержден иммуногистохимическим методом, показав снижение интенсивности сигнала в GFP-положительных клетках.
Анализ интенсивности сигнала GFP-положительных клеток выявил значительное снижение уровня белка PCGF4 в образцах с нокаутом по сравнению с контрольной группой.
