Насколько нам известно, этот протокол является первым, в котором получены децеллюляризированные матрицы из скелетных мышц плода, что обеспечивает новый подход к изучению миопатий, которые начинают развиваться в утробе матери. Этот протокол генерирует метрики развития и тканевые показатели, которые могут быть использованы для изучения поведения мышечных клеток и взаимодействия с внеклеточным матриксом в контролируемой среде. LAMA2-CMD - это врожденная мышечная дистрофия, которая начинает проявляться при рождении.
Эта модель может помочь разгадать паттерновые механизмы, участвующие в его возникновении, и привести к новым целевым методам лечения. Этот протокол может быть адаптирован к различным тканям и моделям заболеваний. Различные уровни сложности могут быть достигнуты в зависимости от типов матриц и ячеек, что демонстрирует универсальность системы.
Это очень простой протокол. Самая сложная часть - это сбор и обработка образцов. Но с практикой технические навыки можно легко улучшить.
Начните с переноса одного усыпленного плода за раз в чашку Петри, содержащую ледяной PBS. После иссечения кожи и конечностей разрезают вентральную сторону грудной клетки. Удаляют грудину и подлежащие органы.
Расположите плод тыльной стороной вверх и удалите шейную часть позвоночника. Затем иссекают жировые отложения спины и соединительную ткань глубоких мышц спины. Теперь закрепите грудную клетку с помощью хирургических щипцов.
С помощью микроскальпеля осторожно соскребите, чтобы отделить глубокие мышцы спины от окружающих тканей. Храните ткани в PBS в 12-луночной тарелке для культивирования клеток при четырех градусах Цельсия для использования в будущем. В течение более длительного периода храните ткань в пустой микроцентрифужной пробирке при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
В первый день используйте целые эпаксиальные мышечные массы. Добавьте три миллилитра гипотонического буфера, содержащего 1% пенициллина и стрептомицина, в каждую лунку 12-луночной пластины. Добавьте фрагмент мышечной ткани в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи в течение 18 часов при перемешивании.
На второй день удалите буфер пипеткой с тонким наконечником. Теперь промойте образцы три раза тремя миллилитрами PBS с часовым перемешиванием каждый раз. После выброса PBS инкубируйте образцы в трех миллилитрах 0,05%-ного раствора моющего средства SDS в течение 24 часов при перемешивании.
На третий день с помощью пипетки с тонким наконечником удалите моющее средство SDS и трижды промойте фрагменты тремя миллилитрами гипотонического буфера для стирки с 20-минутным перемешиванием каждый раз. Замените раствор лунок двумя миллилитрами раствора ДНКазы и инкубируйте фрагменты тканей при 37 градусах Цельсия в течение трех часов с перемешиванием. После удаления раствора ДНКазы трижды промойте фрагменты тремя миллилитрами PBS с 20-минутным перемешиванием каждый раз, оставляя последнюю промывку на ночь.
В колбу Т-25, засеянную субсливными клетками C2C12, добавьте 500 микролитров трипсина и ресуспендируйте в одном миллилитре полной среды. Смешайте 10 микролитров суспензии с 10 микролитрами красителя трипанового синего и загрузите в гемоцитометр для подсчета количества клеток и оценки жизнеспособности. В вытяжном шкафу с ламинарным потоком поместите децеллюляризированные матрицы, или dECM, в чашку Петри, содержащую PBS с 1% пенициллином и стрептомицином.
С помощью микроскальпеля и пинцета разделите матрицы на небольшие кусочки. Перенесите фрагменты в лунки 96-луночной плиты, уложив по три-четыре штуки на лунку. Добавьте 200 микролитров предварительно подогретой полной питательной среды в каждую лунку и выдерживайте тарелку в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.
Отбросьте среду в луночную пластину и добавьте 200 микролитров полной питательной среды, содержащей 50 000 жизнеспособных клеток C2C12, в каждую лунку. Выдерживают в лунке двое суток. Перенесите dECM с клетками в 48-луночную пластину, содержащую 400 микролитров полной питательной среды.
Тщательно аспирируйте среду каждые два дня, чтобы предотвратить отслоение матрицы, и пополняйте свежей средой до восьмого дня. Для дифференциации замените полную питательную среду дифференцировочной средой и инкубируйте в течение четырех дней до 12-го дня. Мышечная ткань была красноватой сразу после изоляции и стала белой из-за лизиса клеток после инкубации в гипотоническом буфере.
SDS заставляет мышцы становиться прозрачными. После обработки ДНКазой был получен меньший прозрачный dECM. Количественное определение ДНК показывает почти 100%-ное снижение dECM по сравнению с нативной тканью.
dECM и нативная ткань показали сходное канальцевое окрашивание для ламинина альфа два и белка ламинина. Вестерн-блоттинг-анализ нативной ткани показал две полосы для двух субъединиц ламинина альфа, в то время как три меньших полосы были обнаружены в dECM. Что касается общего количества ламининов, образцы dECM показали фрагментацию белка по сравнению с нативной тканью.
Фибронектин и коллаген I присутствовали в интерстициальном пространстве между клетками нативной ткани и dECM. Аналогичные полосы фибронектина присутствовали в обоих образцах, что указывает на то, что на него не влияет децеллюляризация. Меньшее количество полос коллагена I наблюдалось в dECM.
Для коллагена IV оба образца показали одинаковое канальцевое окрашивание. Однако молекулярная масса полос dECM была ниже. Клетки C2C12 колонизировались и размножались в dECM и сливались в многоядерные миотубы.
Они экспрессировали миозин-тяжелый цепной белок после четырех дней инкубации в дифференцировочной среде. Внутриклеточное и перицеллюлярное окрашивание наблюдалось для ламинина альфа-две цепи, общих ламининов и фибронектина. Децеллюляризированные скелетные каркасы эмбриональных мышей можно использовать для выращивания клеток в системах совместного культивирования, приближая их к ситуации in vivo и, следовательно, способствуя пониманию мышечных заболеваний.
