Диффузное распределение и ограниченный визуальный диапазон ПЭМ создают проблемы для инфраструктурного анализа. Этот протокол представляет собой инновационный и эффективный метод пробоподготовки, который превосходит традиционный подход. Этот усовершенствованный метод пробоподготовки ПЭМ более эффективен в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом, позволяя образцам оставаться плоскими во время последующего обезвоживания.
Подбор реагентов и корректировка дозировки должны быть необходимы в зависимости от типа образца. В процессе пробоподготовки используется множество токсичных химических реагентов. Демонстрировать процедуру будет Шэн Цинъюань, студент магистратуры из лаборатории доктора Гань Гуанмина.
Для начала препарируйте блуждающие личинки дрозофилы позднего третьего возраста в растворе Jan и получите всю стенку тела в соответствии со стандартными процедурами. Закрепите стенку тела личинки с помощью фиксатора в камере вскрытия на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день перенесите стенку тела личинки из камеры вскрытия в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, и несколько раз промойте ее буфером из какодилата натрия.
Закрепите стенку тела личинки в 1%-ном тетраоксиде осмия на два часа. После фиксации несколько раз промойте образцы дистиллированной водой. Добавьте в пробирку 2% насыщенный раствор ацетата мочеприемника, чтобы окрашивать нервно-мышечное соединение PHI.
А через два часа промойте образцы деионизированной водой. Далее с помощью ножниц вырежьте два круглых отрезка металлической сетки с размером пор 270 мкм. Поместите металлическую сетку в основание бутылки с плоским дном.
Затем поместите неподвижных личинок на сетку, после чего поместите еще одну сетку. Обезвоживайте образцы в возрастающей концентрации этанола в течение 20 минут каждый при четырех градусах Цельсия. Затем дважды промойте образцы оксидом пропилена при комнатной температуре в течение пяти минут каждый.
Затем поместите образцы в раствор оксида пропилена и эпоксидной смолы, а затем в чистую эпоксидную смолу на два часа при комнатной температуре. Для заделки разрежьте полиэтиленовую пленку на большой квадрат и маленькую полую прямоугольную опору. Соедините маленький квадрат с большим квадратом.
Добавьте достаточное количество эпоксидной смолы в центр большого квадрата. Затем включите стереоскоп и поместите образцы в предварительно нанесенную эпоксидную смолу мышечной стороной вверх. Добавьте на образцы несколько капель эпоксидной смолы, и накройте их полиэтиленовой пленкой.
Поместите образцы для полимеризации при возрастающей температуре на 24 часа каждый. После полимеризации с помощью острого лезвия удалите лишние части тела личинки с сохранением трапеции, в том числе сегмент А2 и А3. Удалите трапецию с оставшейся стенки тела личинки и прикрепите ее к капсуле, наполненной смолой, с помощью клея AB.
Под световым микроскопом подтвердите положение шестой и седьмой мышц сегментов А2 и А3, сохраняя плоскость касательной, параллельную шестой мышце. Затем отрежьте одну пятую часть образца по двум сторонам сегмента А3. С помощью микротома подготовьте ультратонкий срез образца, начиная с шестой мышцы.
После разрезания прикрепите к каждой медной сетке как можно больше срезов. Используйте просвечивающий электронный микроскоп для наблюдения за образцами. Среди смолы Lowicryl K4M и эпоксидной смолы, смола Lowicryl K4M обеспечивала более четкие и легко наблюдаемые результаты мышц тела дрозофилы.
Конфокальная визуализация продемонстрировала улучшенную визуализацию нервно-мышечного соединения между шестой и седьмой мышцами. Просвечивающая электронная микроскопия выявила бисероподобные нервно-мышечные соединения, что дает улучшенную информацию о синаптической структуре. Образцы оставались плоскими на протяжении всего процесса обезвоживания из-за ограничения металлических сеток.
Кроме того, образцы полимеризуются между пластиковыми изделиями, что предотвращает их сворачивание. В будущем метод пробоподготовки ПЭМ может быть применен к нейропилю головного и вентрального нервного канатика, тем самым улучшая потенциал ультраструктурных исследований.
