Препарат одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для секвенирования одноклеточных клеток

Этот протокол обеспечивает надежную справочную информацию для получения высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для облегчения исследований на уровне отдельных клеток у видов рыб аквакультуры. Технология отличается высокой эффективностью и может быть реализована в большинстве лабораторных условий. Это снижает потребность в дополнительных испытаниях для приготовления одноклеточных суспензий для видов рыб аквакультуры.

Начните с ополаскивания шестимесячной рыбы нильской тилапии в хорошо аэрированной стерильной воде в течение 15 минут, чтобы смыть неплотно связанные бактерии с поверхности. Для приготовления ферментативного реагента для диссоциации клеток разбавьте диспазу коллагеназы в PBS до конечной концентрации один миллиграмм на миллилитр. Смешайте 95% объема приготовленного ферментативного раствора и 5% объема FBS.

Затем предварительно охлаждают центрифугу до четырех градусов Цельсия перед использованием. Для рассечения тканей поместите усыпленную рыбу на лед и соберите три-четыре сантиметра средней части кишечника. Иссекают жир и брыжейку с помощью щипцов.

Удалите жир, прикрепленный к поверхности кишечника, и эластичную и податливую прозрачную слизистую оболочку. Аккуратно промойте фрагмент кишечника стерильным ледяным PBS с помощью шприца, чтобы смыть содержимое кишечника и слизь. После нескольких промывок рассеките фрагмент на мелкие кусочки и переложите их в пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр ледяного PBS.

Центрифугируйте смесь при температуре 300 x g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. И замените надосадочную жидкость одним миллилитром ледяного 0,08% BSA-DPBS. С помощью стеклянной пипетки аккуратно аспирируйте, чтобы ресуспендировать фрагменты ткани.

Промыв кусочки еще раз, удалите надосадочную жидкость и добавьте один миллилитр приготовленного ферментативного диссоциирующего реагента. Также смешайте пять микролитров ингибитора РНК с реагентом диссоциации для секвенирования одноклеточной РНК. Поместите пробирку на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия и вручную переворачивайте пробирку каждые пять минут в течение 30-60 минут инкубации.

После того, как трубки будут раскручены, удалите ферментативный реагент для диссоциации клеток с помощью широкопроходных наконечников. Добавьте один миллилитр ледяного 0,08% BSA-DPBS и аккуратно пипеткой нанесите на клетки вверх и вниз, чтобы предотвратить разрушение клеток. После центрифузии и ресуспендирования клеток еще раз поместите 40-микрометровый сетчатый фильтр, предварительно смачиваемый 0,08% BSA-DPBS, на коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Пропустите клеточную суспензию через ситечко. Постучите по ситечку, затем промойте его 200 микролитрами DPBS и соберите суспензию на дне пробирки. После переноса суспензии в пробирку объемом 1,5 миллилитра добавьте пять микролитров ДНК и инкубируйте суспензию в течение 15 минут при температуре от 15 до 20 градусов Цельсия.

После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу клетки в 400 микролитрах ледяного DPBS без ионов кальция и магния. Затем аккуратно пипеткой вверх и вниз с широкими наконечниками, чтобы перемешать клетки, и повторите этот процесс еще раз. Для окрашивания смешайте клеточную суспензию в 0,4%-ном растворе трипанового синего в равном соотношении и выдержите три минуты при комнатной температуре.

Затем добавьте 10 микролитров смеси на предметное стекло. Подсчитайте жизнеспособные и мертвые клетки под микроскопом в трех полях и рассчитайте процент жизнеспособности клеток. Было проведено сравнение эффективности диссоциации нескольких широко используемых ферментов.

Было подтверждено, что смесь диспазы коллагеназы обладает лучшим эффектом диссоциации, чем только диспаза коллагеназы или трипсин и несколько других ферментных смесей. Микроскопическое исследование показало, что клетки кишечника обладают высокой жизнеспособностью и рассеиваются в виде одиночных клеток. Большинство клеток были жизнеспособными, в то время как некоторые из них были окрашены мертвыми из-за проницаемой клеточной мембраны.

Обратите внимание на тип используемого PBS. Ферментативный раствор для пищеварения нельзя использовать с PBS, не содержащим кальция / магния, поскольку для эффективного функционирования фермента требуются ионы кальция / магния. Эта процедура облегчает исследования на уровне отдельных клеток видов рыб аквакультуры, обеспечивая ценный ориентир для разработки протоколов диссоциации клеток видов рыб аквакультуры.