Мы разработали стабилизированную эмульсию Пикеринга с наночастицами PLGA. Эмульсия Пикеринга улучшила клеточное сродство к клеткам антигенного белка, вызывая эффективную интернализацию антигенов. Стабилизированные наночастицами эмульсии Пикеринга были просты в приготовлении и эффективной доставке антигена.
Кроме того, был использован метод для мониторинга сродства эмульсии к клетке и разработки интернализации. Этот протокол предоставляет информацию для разработки новых составов с высокой эффективностью клеток и эффективной интернализацией антигена, которые обеспечивают платформу для разработки эффективных вакцин. Для начала добавьте 100 миллиграммов полимолочно-согликолевой кислоты к 10 миллилитрам смеси ацетона и этанола в соотношении четыре к одному, чтобы служить масляной фазой.
Поместите 20 миллилитров водного раствора ПВА под вытяжной капот и магнитно перемешайте со скоростью 400 оборотов в минуту. Добавьте пять миллилитров масляной фазы в раствор ПВА по каплям с помощью шприцевого насоса. Затем перемешайте смесь в вытяжном шкафу до полного испарения органических растворителей.
После испарения органических растворителей центрифугируют смесь при 15 000 г. Промывайте три и более раз до тех пор, пока окончательная промывочная вода не станет прозрачной и прозрачной. Повторно суспендируйте промытые наночастицы PLGA в двух миллилитрах деионизированной воды и заморозьте смесь при 80 градусах Цельсия в течение 24 часов. Чтобы охарактеризовать размер и дзета-потенциал наночастиц PLGA, добавьте 10 микролитров наночастиц PLGA в один миллилитр деионизированной воды для получения раствора разбавителя и переноса раствора разбавителя в ячейку DTS1070.
Включите компьютер и динамический анализатор рассеяния света. Затем поместите ячейку DTS1070 в систему DLS. Нажмите на программное обеспечение Zetasizer и создайте новый файл измерений, чтобы настроить процедуру определения.
Затем начинают процедуру определения размера частиц и распределения дзета-потенциала. Для получения стабилизированной эмульсии Пикеринга, или PNPE, добавляют лиофилизированные наночастицы PLGA в деионизированную воду в концентрации четырех миллиграммов на миллилитр, а затем добавляют сквалан в качестве масляной фазы. Приготовьте PNPE с помощью одноступенчатой обработки ультразвуком в течение пяти минут при 100 Вт в ультразвуковом аппарате для водяной бани.
Разбавьте 20 микролитров PNPE и один миллилитр деионизированной воды. Опустите 20 микролитров эмульсии на предметное стекло. Наблюдать морфологию и однородность эмульсии с помощью оптической микроскопии при 40-кратном увеличении и получать фотографии.
Включите отжимной коатер, нажав кнопку питания. Нажмите кнопку управления и установите время и скорость покрытия. Подключите азотную трубу к отжимному коатеру и отрегулируйте фракционирование газового баллона до 0,4 килопаскаля.
Поместите чистый чип на присоску отжима. Добавьте 100 микролитров поли-l-лизина по каплям к центру датчика диоксида кремния и закройте верхнюю крышку спин-коатера. Нажмите кнопку запуска, чтобы начать нанесение покрытия на образец и остановить машину по завершении.
Выключите вакуумный насос, выключите кнопки питания и управления и снимите датчик диоксида кремния, модифицированный поли-l-лизином. Чтобы определить адгезию биомиметических внеклеточных везикул к PNPE, включите компьютер, электронный блок и перистальтический насос и активируйте контроль температуры в правом нижнем углу программного обеспечения, чтобы гарантировать, что установленная температура примерно на один градус Цельсия ниже комнатной температуры. Поместите модифицированные поли-l-лизин датчики диоксида кремния в проточную ячейку в соответствии с инструкциями по эксплуатации и подключите измерительную линию между проточной ячейкой и проточным насосом.
Поместите проточную ячейку внутрь системы модуля потока. Нажмите на панель инструментов «Приобретение» и выберите «Измерение настройки» для поиска 1, 3, 5, 7, 9 и 11 октав чипа в используемом канале. Чтобы скорректировать базовую линию, нажмите «Начать измерение», чтобы позволить воздуху поступать в модуль потока до тех пор, пока воздушная базовая линия не станет гладкой.
После проточия деионизированной воды в течение 10-15 минут, чтобы снова обеспечить исходное равновесие раствора, перекачиваем приготовленный раствор PNPE в проточный модуль со скоростью потока 50 микролитров в минуту для достижения равновесной адсорбции на датчике диоксида кремния. Перекачиваем приготовленный биомиметический внеклеточный везикулярный раствор в проточный модуль со скоростью потока 50 микролитров в минуту для отслеживания процесса адгезии bEV к поверхности PNPE. Инкубируйте дендритные клетки костного мозга с 1640 полными средами в течение семи дней, а затем засевайте их в небольшие конфокальные лазерные тарелки в 1 раз 10 до 6 на лунку в течение ночи при 37 градусах Цельсия и инкубаторе углекислого газа 5%.
Смешайте 0,5 миллилитра цианина 5 с меченым овальбумином, с 0,5 миллилитрами PNPE в течение одного часа и удалите жидкий антиген центрифугированием при 5000 г в течение 20 минут для разработки вакцинной формулы. После повторной суспензии с 200 микролитрами деионизированной воды добавьте 10 микролитров состава в небольшие конфокальные лазерные тарелки под суперчистой скамьей и совместно культивируйте с дендритными клетками костного мозга в течение шести часов. После удаления культуральной жидкости из клеток дважды промыть их предварительно подогретым фосфатным буферным физиологическим раствором.
Зафиксируйте клетки 4%-ным раствором формальдегида и PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Промывайте ячейки PBS два или три раза при комнатной температуре в течение 10 минут каждая. Пермеабилизируют клетки 100 микролитрами 0,5%-тритона Х-100 раствора в течение пяти минут при комнатной температуре.
После повторного промывания клеток PBS накройте ячейки на стеклянной нижней посуде небольшой конфокальной лазерной посуды 200 микролитрами флуоресцеина изотиоцианата конъюгированного рабочего раствора фаллоидина и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После промывки клеток PBS три раза в течение пяти минут каждая, пополните ядра 200 микролитрами раствора DAPI в течение примерно 30 секунд. Для анализа изображений включите аппаратное обеспечение конфокального микроскопа последовательно, включая лазер, конфокальный, микроскоп и компьютер.
Щелкните программное обеспечение и выберите Nikon Confocal, чтобы войти в систему тестирования. В системе конфокального микроскопа включите различные блоки в указанном порядке. Во-первых, настройте каналы FITC, DAPI и Cy5 и настройте соответствующий HV и смещение.
Затем после выбора 100-кратной масляной линзы и нанесения капли кедрового масла сверху на место небольших конфокальных лазерных тарелок, содержащих окрашенные дендритные клетки костного мозга на стадии микроскопа. Нажмите кнопку сканирования. Под флуоресцентным микроскопом найдите интересующие клетки, переместив ось X, ось Y и ось Z.
Настройте интенсивность лазера, размер изображения и другие параметры, чтобы обеспечить сканирование высококачественных конфокальных изображений. Наконец, нажмите кнопку «Захват» и сохраните изображения. Адгезия биомиметических внеклеточных везикул к PNPE отслеживалась с помощью QCM-D.
Немедленное снижение частоты, указывало на быструю адгезию биомиметических внеклеточных везикул к ПНПЭ после встречи. Кроме того, дельта F уменьшалась с увеличением концентрации биомиметических внеклеточных везикул, отражая концентрационно-зависимый эффект. Микрочастицы PLGA и стабилизированная поверхностно-активным веществом наноэмульсия были слабо связаны с биомиметическими внеклеточными везикулами даже при высокой концентрации 80 микрограммов на миллилитр, что, вероятно, было результатом отсутствия контактов с иммунными клетками.
Флуоресцентный сигнал цианина-5 овальбумина показал, что общее количество антигена, интернализованного в клетки, значительно выше в группе, получавшей PNPE, по сравнению с группой, обработанной микрочастицами PLGA и поверхностно-активными веществами, стабилизированной наноэмульсией. Количественный анализ клеточного поглощения показал значительно более высокую относительную интенсивность флуоресценции и дендритных клеток костного мозга, обработанных PNPE, чем у клеток, обработанных микрочастицами PLGA и стабилизированной поверхностно-активной наноэмульсией. Полученные результаты показали, что PNPE способствует интернализации антигена и эффективно доставляет антиген внутриклеточным путем.
Для получения однородной эмульсии смесь необходимо непрерывно встряхивать во время обработки ультразвуком.
