Plasmodiophora brassicae является почвенным обязательным биотрофным патогеном, который поражает растения из семейства Brassicaceae. При заражении возбудитель провоцирует развитие галлов на подземных частях растения, отсюда и название болезни клубный корень. Развитие галлов сопровождается очень сложным перепрограммированием.
Поэтому возможность отслеживать внутренние изменения во время болезни имеет решающее значение для понимания этого взаимодействия растений и патогенов. Наш протокол улучшает визуализацию сложных, толстых и желчных пузырей. Он облегчает визуализацию изменений в экспрессии генов, физиологических реакциях, фитогормоническом балансе, прогрессировании заболевания, распределении спор и локальном лигнификации.
Протокол сохраняет флуоресцентные белки в образцах, что позволяет хранить и обрабатывать объекты в течение длительного времени. Это также позволяет отслеживать биохимические и структурные изменения, сопровождающие прогрессирование заболевания. Продемонстрировать процедуру будут Сара Бличарз, постдокторант в нашей группе, Дикша Сингх, аспирант из нашей лаборатории, и Корнел Михалак, аспирант из группы профессора Агнешки Багневской-Задворны в Университете Адама Мицкевича.
Начните с подготовки растительной ткани. Осторожно удаляйте почву из корневой системы клубне-инфицированных и неинфицированных растений. Тщательно очистите водой и соберите гипокотилы и галлы в микроцентрифужные трубки.
Зафиксируйте образцы в 200-500 микролитрах параформальдегидного фиксатора в течение одного часа при комнатной температуре, применяя постоянный вакуум в 700 миллибар с помощью вакуумного насоса. Убедитесь, что объект полностью погружен в раствор параформальдегида. Используйте 4%агарозу для встраивания неинфицированных гипокотилов и инфицированных галлов.
Вскипятите раствор, чтобы растворить агарозу, и влейте его, когда он остынет, пока он еще вязкий. Слегка высушите предмет на ткани в течение нескольких секунд, чтобы удалить избыток параформальдегида. Используйте зубочистки или щипцы, чтобы аккуратно встроить и сориентировать растительный объект в агарозе.
Чтобы предотвратить косые участки, убедитесь, что объект ориентирован и отлит правильно, чтобы его ось была перпендикулярна плоскости лезвия вибратома. Чтобы ускорить затвердевание агарозы, поместите плиту Петри или мультикультуру при четырех градусах Цельсия на 10 минут. Используя лезвие, аккуратно вырежьте и отформуйте объект внутри блока агарозы, отметив предпочтительную ориентацию для секционирования.
Наклейте блок агарозы или большую желчь, чтобы правильно закрепить его на держателе образца с помощью цианоакрилата или мгновенного клея и маскировочной ленты. Отрегулируйте толщину для сечений, скорость и амплитуду вибрации в соответствии с толщиной и размером галла. Добавьте дистиллированную воду на водяную баню и начните с секционирования.
Тщательно соберите срезы с помощью щипцов или щетки и переложите их в микроцентрифужную трубку, содержащую один миллилитр буфера 1X PBS. Извлеките 1X PBS из трубки микроцентрифуги и добавьте от 200 до 500 микролитров очищающего раствора. Замените очищающий раствор на новый, если его цвет изменится через некоторое время во время обработки образца.
Выполняют калькофтор-белое окрашивание клеточных стенок укладывающих растительных клеток путем получения 5% калькофтор-белого пятна в очищающем растворе. Затем окрашивайте клетки в темноте не менее пяти минут. Окрашивайте липиды нильским красным цветом и лигнины основным окрашиванием лигнином Фуксина, как описано в текстовой рукописи, и монтируйте очищенные участки на слайде микроскопии.
Затем наблюдают за клетками под эпифлуоресценцией или конфокальным микроскопом. Используйте несколько режимов съемки для одновременной визуализации более чем одного флуоресцентного спектра. Динамика заболевания и накопление патогенов отслеживались в галлах, колонизированных Plasmodiophora brassicae, а крупные клетки с спорами покоя P.brassicae наблюдались после окрашивания в красный цвет Нила.
Изменения дифференциации ксилемы при инфекции P.brassicae визуализировали с помощью базового окрашивания Фуксина. Растения Arabidopsis, содержащие конструкцию pHCA2: erRFP, были использованы для визуализации экспрессии гена HCA2 в ткани флоэмы в клубневых галлах. HCA2 совместно локализовался с флоэмой на поздних стадиях развития желчи, управляемого P.brassicae, и активность гена отражала механизм, с помощью которого P.brassicae увеличивает сложность флоэмы.
Через 16 дней после посева дифференциальные реакции цитокинина между инфицированными и неинфицированными растениями оценивали путем проверки экспрессии маркера TCS: GFP в развивающихся галлах. Реакции цитокинина, по-видимому, значительно уменьшились у инфицированных галлов, в то время как они оставались сильными, особенно в пуле флоэм, в неинфицированных растениях. Наиболее важными шагами являются фиксация в PFA, встраивание и секционирование.
Для вибратомного сечения необходимо оптимизировать и тщательно регулировать параметры скорости, амплитуды и толщины для получения высококачественных секций. Методы вибратомного сечения и очистки тканей проложили путь к улучшению микроскопического анализа физиологических реакций во время взаимодействия растений и микробов и тканей, демонстрирующих вторичный рост со сложной клеточной анатомией.
