Наш протокол выделения мезенхимы кишечника приводит к высокому выходу телоцитов. Этот метод предлагает начальную платформу для изучения межклеточного взаимодействия с участием телоцитов в гомеостазе и заболевании. Телоциты являются уникальными клетками, чувствительными к доступным протоколам диссоциации тканей.
Поэтому основным преимуществом данной методики является выделение мезенхимы, включающей обогащенные жизнеспособные телоциты. Мезенхима, включая телоциты, может служить источником сигнальных молекул и факторов роста, необходимых для организованного роста ex vivo. Для начала промойте кишечник, отделенный от усыпленной мыши, в чашке Петри, содержащей холодный стерильный PBS.
Поместите кишечник в чашку Петри. И с помощью ножниц с шариковым наконечником откройте кишечную трубку в продольном направлении и промойте кал. Переложите кишечник в новую посуду, содержащую свежий холодный PBS.
Промыв кишечник еще раз, разрежьте тонкую кишку на сегменты длиной в один сантиметр и перенесите их в коническую трубку объемом 15 миллилитров, заполненную восемью миллилитрами PBS. Встряхивайте трубку вручную со скоростью один или два цикла в секунду в течение одной минуты. Вылейте раствор в чашку Петри.
И с помощью щипцов перенесите сегмент в 50-миллилитровую коническую трубку, заполненную 20 миллилитрами раствора А. Поместите пробирки в орбитальный шейкер-инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 20 минут. После инкубации энергично встряхните трубку вручную со скоростью четыре или пять циклов в секунду в течение одной минуты, чтобы диссоциировать эпителий. Повторите этот шаг еще раз.
После резки и промывки фрагментов, как показано ранее, переложите их в новую 50-миллилитровую пробирку, заполненную 10 миллилитрами стерильного PBS, и переверните пробирку с одним или двумя циклами в секунду в течение одной минуты. Налейте раствор в чашку Петри. Перенесите сегменты в новую 15-миллилитровую пробирку, заполненную 10 миллилитрами стерильного PBS, и осторожно наклоняйте вверх и вниз со скоростью один или два цикла в секунду в течение двух минут.
Под шкафом биобезопасности используйте щипцы, чтобы поместить сегменты на стерильную лабораторную салфетку, чтобы высушить их. После высыхания разрежьте сегменты на кусочки. Переложите нарезанные кусочки с помощью щипцов в шестилуночную пластину, заполненную четырьмя миллилитрами предварительно подогретого раствора для разложения на лунку.
Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 50 минут и осторожно встряхивайте тарелку вручную каждые 20 минут. Затем переложите кусочки с помощью пипетки Пастера в 15-миллилитровую коническую трубку, заполненную четырьмя миллилитрами DMEM. Встряхните трубку вручную со скоростью четыре или пять циклов в секунду в течение одной минуты, чтобы получить одноклеточную суспензию.
Отфильтруйте суспензию через 100-микрометровый сетчатый фильтр в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте фильтрат при 700 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от надосадочной жидкости путем аспирации и ресуспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах 2% FBS / PBS.
После центрифугирования суспензии еще раз в 700 г в течение пяти минут выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу клетки в 12 миллилитрах питательной среды. Наконец, засейте клеточную суспензию в шестилуночные пластины. После диссоциации мезенхимы телоциты теряют свои клеточные характеристики, демонстрируя круглую клеточную морфологию, и отражают меньшее количество GFP-положительных клеток в первый день по сравнению со следующими днями.
Через несколько дней телоциты демонстрируют маленькую, растянутую клеточную морфологию с короткими клеточными отростками. После семи-10 дней посева телоциты восстанавливают свои клеточные характеристики, демонстрируя крупную, растянутую морфологию клеток с длительными цитоплазматическими процессами. Проточная цитометрия выявляет клеточный состав.
В целом, 69% изолированных клеток были жизнеспособными на основе окрашивания DAPI. И из них 60,9% представляли собой эпителиальное загрязнение и иммунные и эндотелиальные клетки. Фракция телоцитов рассеивалась выше 100k и 70k FSC и SSC соответственно и составляла почти 10% закрытой мезенхимы.
Анализ FACS показал, что подмножество телоцитов может быть определено путем положительного окрашивания на CD201 и GP38. Иммуноокрашивание однодневной культивируемой мезенхимы с использованием этих маркеров показало экспрессию этих молекулярных маркеров, несмотря на то, что клетки не проявляли своих клеточных характеристик. Эта процедура приводит к жизнеспособной одноклеточной суспензии стромальных клеток, которая может быть использована не только для 2D-культивирования, но и для любого другого применения, такого как 3D-совместное культивирование с органоидами или биопечать.
