Это парадигма резекции опухоли головного мозга, которая крайне необходима в доклинических исследованиях по терапии опухолей головного мозга. Он позволяет стандартизированную резекцию с помощью минимально инвазивного подхода, в то же время он также связан с автоматизированной системой сохранения тканей. Этот протокол позволяет животному выжить после операции и, таким образом, помогает понять изменения в болезненном состоянии после терапии у того же животного.
Это помогает в последовательных и покадровых терапевтических применениях. Используя эту методику, мы можем оценить биологию заболевания и спланировать возможное последующее лечение. Это имеет значительные последствия и возможности в открытии лекарств и новых терапевтических средствах.
Концепции стандартизированной резекции, минимально инвазивного подхода и автоматизированного сохранения тканей могут быть распространены на другие типы опухолей в различных системах органов, такие как опухоли печени и рак головы и шеи. Протокол прост, а система удобна для пользователя. Лучше всего ознакомиться с опубликованным протоколом, который содержит все необходимые шаги и устранение неполадок.
Начните эксперимент, оценив мышь на седацию, зажав палец ноги. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы избежать сухости роговицы. Затем поместите мышь на стереотаксическую рамку.
Удалите основной продукт из предыдущей операции и продезинфицируйте кожу чередующимися циклами скраба на основе хлоргексидина или бетаина и спирта. Затем создайте сантиметровый продольный разрез средней линии вдоль предыдущего хирургического рубца с помощью стерильного скальпеля. Прикрепите наконечник MIRS к стереотаксическому кронштейну через адаптер сцены.
Чтобы настроить устройство MIRS, вставьте кабель питания, установленный на задней панели, в розетку шнура питания. Включите или выключите питание системы, переключаясь между нулем и единицей. Вставьте один конец азотного шланга в штекерный фитинг на задней панели консоли.
Поверните соединительную гайку по часовой стрелке, чтобы затянуть ее. Убедитесь, что давление подачи не превышает 100 PSIG, и прикрепите шланг к подаче азота. Закройте крышку вакуумного порта, чтобы избежать утечки.
Убедитесь, что ручка аспирации на передней панели консоли установлена на 100, что в системе аспирации нет утечки и что давление подачи азота на входе правильное. Вставьте серый разъем ножной педали в его серую розетку, пока он не щелкнет. Таким же образом вставьте синий разъем наконечника в его синюю розетку.
Загрунтуйте каждый наконечник, аспирируя стерильную жидкость в отверстие через трубку и наконечник, а затем в канистру, чтобы обеспечить смазку внутренней части трубки и наконечника. Выберите режим аспирации на передней панели консоли и инициируйте с помощью ножной педали. Вставьте канюлю 23-G MIRS в отверстие заусенца на глубину 2,5 миллиметра.
Инициируйте процесс резекции, нажимая на ножную педаль, соединенную с канюлей. Выполняйте полные циклы резекции с помощью ручки управления в наконечнике. После процесса резекции извлеките канюлю MIRS 23-го калибра и добавьте пять миллилитров 1X PBS, чтобы промыть трубку и выбить любой остаточный мусор.
Затем закройте рану степлером и извлеките мышь из стереотаксической рамки. Верните мышь на грелку, чтобы восстановиться после анестезии, прежде чем поместить ее обратно в клетку. После эксперимента очистите канюлю охлажденной средой и воздухом, чтобы вытолкнуть всю резецированную ткань обратно в канистру для сбора.
Извлеките из системы канистру для сбора и поместите колпачок. Затем поместите дистальный наконечник канюли в 3% перекись водорода и примените всасывание, чтобы заполнить линию всасывания обратно в канистру для всасывания. Дайте ему постоять от 60 до 90 секунд и периодически пульсируйте воздухом и средой, чтобы промыть его.
Поместите образец опухоли в чашку для культуры тканей, содержащую среду лизиса эритроцитов, на пять минут при комнатной температуре. Затем поместите 70-микронный фильтр на 50-миллилитровую коническую трубку и используйте шприцевой плунжер, чтобы пропустить образец опухоли через фильтр. С помощью переносной пипетки используйте среду RPMI 1640 для пропускания клеток и любой тканевой массы через фильтр.
Центрифуга в 428 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте каждый образец в пяти миллилитрах подготовленной среды RPMI 1640. Поместите образцы в шейкер-инкубатор на 20 минут при 200 об/мин при 37 градусах Цельсия.
После инкубации центрифугируют образцы в 428 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбрасывают супернатант. Фильтруйте отдельные ячейки через 70-микронный клеточный сетчатый фильтр и центрифугу в 274 раза больше G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Проведите анализ жизнеспособности клеток с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
Хирургическая резекция у мышей с использованием MIRS вызвала значительное снижение опухолевой нагрузки, о чем свидетельствует снижение среднего исходного биолюминесцентного сигнала для групп с большой и малой опухолевой нагрузкой. По сравнению с предрезекционными МРТ-изображениями опухолей, резекционная полость может быть идентифицирована на пострезекционных сканированиях как большая, круглая область hypointense в месте посева опухоли. В окрашенных H&E участках наблюдалась четкая круговая резекционная полость с ободком продуктов крови, воспалением и остаточными опухолевыми клетками.
Объем резекции значительно увеличивался при выполнении двух вращений режущего отверстия, что позволило оптимизировать объем резекции в соответствии с опухолевой нагрузкой. Сравнение выживаемости у мышей с необработанными опухолями и мышей, перенесших резекцию опухолей с помощью MIRS, показало увеличение выживаемости с 16 до 22 дней в небольшой опухолевой группе. Аналогичным образом, в группе с большей опухолевой нагрузкой медиана выживаемости увеличилась с 12 до 19 дней.
Изображения световой микроскопии образцов, взятых из системы сохранения тканей, выглядели как одиночные клетки с присутствием нескольких небольших кусков ткани на нулевой день. Через семь дней клетки, собранные с помощью MIRS, показали формирование невросферы в культурах суспензии, что указывало на их потенциал инициации опухоли. Важно продуть и промыть систему труб сразу после процедуры, чтобы избежать засорения системы.
После этой процедуры исследования эффективности терапии и исследования диагностических и прогностических маркеров могут быть использованы на выживших животных после хирургической резекции с помощью минимально-инвазивной резекционной системы.
