Этот протокол последовательно описывает этапы, участвующие в индукции воспаления глазной поверхности и сборе связанных с ним пораженных органов, участвующих в дисфункции мейбомиевой железы. Эта новая модель MGD позволяет исследовать врожденный иммунный аспект заболевания, в частности, образование нейтрофильных внеклеточных ловушек, закупоривающих мейбомиеву железу. Методика, представленная в протоколе, может быть расширена для введения местных терапевтических вмешательств на доклинической стадии.
Кроме того, сбор глазных экссудатов и органов отражает эффективность лечения. Чтобы выполнить внутрибрюшинную инъекцию раствора иммуногена, держите семи-девятинедельную C57 черную шестерку без анестезированной самки мыши мягко за хвост, захватывая сетку клетки. Затем крепко удерживайте кожу спины и области шеи между большим и указательным пальцами и зафиксируйте хвост и нижние конечности между кольцом и мизинцем против ладони.
Удерживая мышь неподвижной головой вниз, вводят 100 микролитров приготовленного раствора иммуногена в правый или левый квадрант нижней части брюшной полости. Чтобы выполнить исследование глазной поверхности после иммунизации, нанесите пять микролитров овальбумина или яйцеклетки или физиологического раствора на глаз анестезируемой мыши и подождите пять минут, чтобы капля впиталась глазом. Затем соберите глазные экссудаты, нанеся 50 микролитров стерильного физиологического раствора на глаз сразу после вызова.
Для иссечения тканей глазной поверхности поместите мышь на ровную поверхность и продезинфицируйте орбитальную область вокруг глаза 70% этаноловым тампоном. Чтобы сформировать разрез вокруг глаза, сделайте разрез между ухом и ретроорбитальной пазухой и вдоль поверхности над плоской костью вертикально, расширяя разрез горизонтально ниже нижнего века вдоль верхнечелюстной кости и над верхним веком вдоль лобной кости. Осторожно подержите рассеченную ткань вокруг глаза с помощью изогнутых щипцов и вытащите ткань и глазное яблоко.
Поместите иссеченные органы в стерильный PBS. Затем, используя скальпель под стереомикроскопом, обрежьте лишнюю лицевую мышечную ткань вокруг иссеченных верхних век. Для сбора конъюнктивы поместите верхнее веко на сухую чашку Петри.
Затем с помощью тонкого пинцета и скальпеля аккуратно очистите беловатый слой слизи от внутренней поверхности века. Рядом, чтобы рассечь роговицу, поместите глазной шар на новую сухую чашку Петри поверх сухого льда. Через три минуты поместите блюдо на поверхность скамейки в устойчивом положении.
Используйте тонкие, острые ножницы, чтобы сделать небольшой разрез на границе роговицы рядом с лимбом. Продолжайте разрез скальпелем вокруг глазного шара, отделяя склеру от роговицы. Затем удалите остатки радужной оболочки и хрусталика с задней стороны роговицы, щедро промыв солевым раствором.
Чтобы оценить мейбомиеву железу и ее отверстия, поместите иссеченные веки в вертикальное положение под стереомикроскопом. Затем, в соответствии со временем экспозиции камеры и настройками ISO, захватывайте изображения при эпиосвещении белым светом. Чтобы оценить площадь мейбомиевой железы, поместите иссеченные веки в горизонтальное положение и включите подсветку стереомикроскопа, оснащенного инфракрасной камерой.
Делайте снимки, регулируя время экспозиции в соответствии с ISO камеры. Мыши, введенные физиологическим раствором, показали здоровые глазные поверхности с широко открытыми глазами. Для сравнения, применение яйцеклеток вызывает сильное воспаление глазной поверхности, узкое отверстие глаз и признаки хемоза.
Иссеченные веки показали большие окклюзии, закупоривающие отверстия мейбомиевой железы и отеки, в отличие от здоровых век, показывающих небольшие пробки железы, выстилающей веко. Дальнейшее исследование инфракрасной трансиллюминации железы выявляет рацемический вид ацинушек мейбомиевой железы. Веки солевых мышей показали круглые ацинусы.
Для сравнения, применение яйцеклеток индуцировало разрушение и потерю некоторых желез с аллергическим заболеванием глаз или AED. Гистологический анализ век показал расширенные мейбомиевые железы по сравнению с мышами, которым вводили только физиологический раствор. Инкубация глазного яблока на сухом льду позволяла делать разрез на роговице рядом с лимбусом и отделять роговицу от склеры.
Это исследование облегчило сбор роговицы. Кроме того, введение яйцеклеток вызывало сильное воспаление конъюнктивы с гиперемическим видом. Повышенные уровни хемокина CXCL-1 способствуют экстравазации нейтрофилов, фагоцитозу и дегрануляции, а интерлейкин-6, опосредующий реакцию острой фазы и инфильтрацию нейтрофилов, наблюдался в супернатантах мышей с AED.
С другой стороны, концентрация интерлейкина-10 не показала существенных изменений как у наивных, так и у AED мышей. Эта новая модель позволяет разрабатывать и оценивать эффективность лекарств, которые нацелены на врожденные иммунные пути, и оказывает большую помощь в анализе данных о способе введения противовоспалительных агентов. После соответствующего сбора органов высоко мультиплексные методы, такие как секвенирование одиночных клеток и массовая цитометрия изображений, совместимы с этим протоколом.
