Значение протокола зависит от уменьшения человеческих ошибок и микробиологического загрязнения. Кроме того, отвечает за производство тысяч сфероидов для 3D-биопечати подходов. Основным преимуществом этого вопроса, однако, является то, что он оптимизирует рабочее время.
Параметры программного обеспечения имеют решающее значение, поскольку они могут влиять на конечное качество сфероидов. И лучшим советом было бы проводить тесты только с клеточными культуральными средами. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что это старый традиционный метод 3D-культуры клеток, основанный на Бегине путем сбора суспензии стволовых клеток с серологической пипеткой 10 миллилитра и переноса ее в 50-миллилитровую центрифужную трубку.
Затем центрифугируют при 400 RCF в течение 5 минут, чтобы получить гранулу ASC. Повторное суспендирование клеточной гранулы с использованием DMEM-Low, содержащей 10% FBS. После подсчета клеток возьмите ИСС в отдельные 15-миллилитровые центрифужные трубки, чтобы засеять 81 и 256 рецессий, микроформованных неадгезивным гидрогелем.
Обратитесь к текстовой рукописи для получения подробной информации о количестве используемых ячеек. Добавьте 500 микролитров стерильного 2% ультрачистого раствора агарозы в центр силиконовой формы, содержащей 81 или 256 круглых углублений. Через 40 минут отформуйте ультрачистую агарозу из силиконовой формы и поместите ее в колодец из 12-луночной пластиковой пластины.
Добавьте два миллилитра DMEM-Low в скважину с микроформованной агарозой и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с подачей углекислого газа 5% в атмосферу в течение не менее 12 часов перед посевом ИСС. Убедитесь, что ламинарный поток включен, а воздушный поток шкафа работает правильно. Убедитесь, что оборудование подключено к правильному напряжению, а планшет подключен к оборудованию.
Проверьте, находится ли высота защитного стекла шкафа на том же уровне, что и маркировка датчика оборудования. Нажмите кнопку включения или выключения на левой стороне оборудования. Затем дождитесь запуска планшета и оборудования.
Расположите наконечники коробок, стойку для трубок центрифуги и пластину, содержащую микроформованный гидрогель агарозы, в рабочем пространстве оборудования. В программном обеспечении, открытом на планшете, щелкните Редактор LabWare. Установите виртуальный рабочий стол и выберите положения пипеток, коробок для наконечников, стойки для пластиковых трубок и пластин.
Нажмите на кнопку «Переключиться на процедуру», чтобы включить все параметры и команды, выполняемые оборудованием на протяжении всего эксперимента. Дождитесь открытия панели инструментов и списка процедур в программном обеспечении. Первоначально, чтобы указать команды, включите количество образцов для пипетирования и перетащите их в список процедур.
Затем нажмите на командную кнопку «Перенос реагента» на программном обеспечении, чтобы перенести суспензию ASC в скважины 12-луночной пластины, содержащей микроформы, и перетащите ее в список процедур. Нажмите на свойства "чтобы настроить начальную" и конечную" позиции для оборудования для передачи образца. Подождите, пока программное обеспечение вернется на страницу Рабочая таблица.
Настройте параметры для автоматического заполнения ИСС, как описано в тексте рукописи. Выберите воду в качестве стандартного типа жидкости. Нажмите на кнопку «Параметры», чтобы настроить параметры для создания однородной приостановки ИСС, как описано в текстовой рукописи.
Нажмите на кнопку с символом «галочки» на верхней панели программного обеспечения, чтобы убедиться, что нет ошибки программирования. Нажмите кнопку воспроизведения на верхней панели программного обеспечения, чтобы запустить программу. Пусть оборудование запускается так, как запрограммировано.
И подождите, пока он издаст звук, указывающий на то, что он закончил. Соберите 12-луночную пластину, а затем инкубируйте ее при 37 градусах Цельсия с 5% атмосферным запасом углекислого газа в течение не менее 18 часов, чтобы обеспечить полное и компактное образование сфероидов. Вручную собирайте сфероиды после одного, трех и семи дней культуры для анализа.
Промывайте среду микропипеткой, чтобы освободить сфероиды от микроформованного неадгезивного гидрогеля агарозы. Соберите сфероиды вручную с помощью микропипетки и перенесите их в 15-миллилитровую центрифужную трубку. В общей сложности 85 и 160 сфероидов были измерены из микроформованных неадгезивных гидрогелей с 81 и 256 круговыми рецессиями соответственно.
Автоматическая система пипеток за 15 минут засеяла суспензию ячейки ASC в 12 лунок одной пластины из 12 лунок. Используя 81 микроформованный неадгезивный гидрогель, в этом исследовании было получено 972 сфероида. В то время как 256 микроформованных неадгезивных гидрогелей, произвели 3072 сфероида.
Сфероиды ASC были проанализированы на однородность их размера и формы. Стероиды ASC из микроформ с 81 рецессией показали однородный диаметр в период культивирования. В отличие от стероидов ASC из микроформ с 256 рецессиями, соотношение наименьших и самых больших диаметров было близко к единице в сфероидах ASC из микроформ с 81 и 256 рецессиями.
Анализ жизнеспособности, морфологии и силы свидетельствует об успешном крупномасштабном производстве сфероидов САС. Самый большой случай заключается в том, чтобы проблема была решена резко без ошибок.
