Анализ эндогенных пептидов, которые меньше, чем большинство белков, но больше, чем многие переваренные пептиды, является исследуемой областью. Этот протокол обращается к scap в рабочих процессах на основе масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия очень чувствительна и может быть использована для нацеливания на конкретные нейропептиды, представляющие интерес, или может захватывать и обнаруживать ряд нейропептидов в образце.
Количественное определение и локализация экспрессии нейропептидов масс-спектрометрией может привести к разработке пептидной терапии и открытию нейропептидных биомаркеров для различных заболеваний. Чтобы начать экстракцию нейропептидов, соберите мозговую ткань у ракообразного и с помощью щипцов немедленно поместите по одной ткани в трубку объемом 0,6 миллилитра, содержащую 20 микролитров подкисленного метанола. Добавьте в образец 150 микролитров подкисленного метанола.
Установите общее время пациента Sonic на 24 секунды, время пульса на восемь секунд. Время паузы до 15 секунд амплитуды до 50% на ультразвуковом гомогенизаторе и гомогенизация образцов на льду. Центрифугируйте образец при четырех градусах Цельсия при 20 000 GS в течение 20 минут.
С помощью пипетки переносят супернатант в трубку и сушат его в вакуумном концентраторе примерно при 35 градусах Цельсия. Для обессоливания восстанавливают извлеченный образец ткани в 20 микролитрах 0,1% муравьиной кислоты. Вихрьте раствор и обработайте ультразвуком на водяной бане комнатной температуры в течение одной минуты.
Нанесите 0,5 микролитра образца на полоску pH, чтобы подтвердить, что pH меньше четырех. Центрифуга при четырех градусах Цельсия и 20 000 GS в течение 30 секунд. Подготовьте смачивающую уравновешивающую промывку в иллюзионных растворах.
Получите 10-микролитровый обессоливающий наконечник со смолой C18. Поместите обессоливающий наконечник на 20-микролитровую пипетку, установленную на 15 микролитров. Аспирируйте наконечник три раза смачивающим раствором и три раза решением для совместной работы.
Аспирировать в образце 10 раз с последующей промывкой три раза в моющем растворе, отбрасывая каждую промывку. Элюировать путем аспирации по 10 раз в каждом из иллюзионных растворов в порядке увеличения ацетонитрила. Высушите упомянутые нейропептиды в вакуумном концентраторе.
Восстанавливают высушенные обессоленные нейропептиды в пяти микролитрах 0,1% муравьиной кислоты. Вихрьте раствор и обработайте его ультразвуком на водяной бане комнатной температуры в течение одной минуты. Кратко центрифуга при 2000 GS. Для обнаружения нейропептидов и тканей земной коры пипеткой на гидрофобную пленку наносится трехмикролитровая капля образца.
Пипетка три микролитра матрицы DHB непосредственно на капле образца. Перемешайте растворы путем пипетки вверх и вниз. Пипетка одного микролитра смеси образца и матрицы в скважину из целевой пластины из нержавеющей стали MALDI и использование наконечника пипетки для распределения каждой смеси по краям пробной скважины.
Нанесите один микролитр калибра один к одному и матричную смесь в скважину рядом с образцом. Вставьте целевую пластину, содержащую высушенные пятна для образцов, в тандемный прибор MALDI для определения времени пролета. С матрицей DHB, устанавливающей мощность лазера на 95%, выберите автоматический оптимальный коэффициент усиления детектора и интеллектуальный режим перемещения полного носителя образца образца.
Получите MS Spectra в диапазоне от 200 до 3 200 М над Z и добавьте несколько спектров из каждой точки вместе, чтобы увеличить отношение нейропептидного сигнала к шуму. Наполните половину чашки криостата желатином и дайте ей затвердеть при комнатной температуре. Держите оставшийся жидкий желатин теплым на водяной бане 37 градусов по Цельсию.
Соберите желаемую нейрональную ткань у животного и используйте щипцы, чтобы немедленно окунуть ткань в 0,6 миллилитровую трубку, содержащую деионизированную воду на одну секунду. Поместите ткань поверх твердого желатина и заполните остальную часть чашки криостата жидким желатином. Используйте щипцы для позиционирования ткани.
Поместите чашку криостата на ровную поверхность и заморозьте сухим льдом. Для подготовки к разделению отделите желатиновый встроенный образец от криостатной формы, отрезав форму. Установите внедренную ткань на криостатный патрон, пипетируя одну миллилитровую каплю деионизированной воды на патрон и немедленно надавливая на внедренную ткань на каплю.
После замораживания пипетки, больше деионизированной воды вокруг ткани, чтобы дополнительно закрепить ее на патроне. Срез ткани приблизительной толщины одной клетки. Большой палец установит каждую секцию на стеклянную заставку с оксидом индия, поместив одну сторону слайда рядом с секцией и поместив палец на другую сторону слайда, чтобы медленно согреть стекло и позволить секции прилипнуть к слайду.
Экспорт De Novo только пептиды. CSV от пиков со средним локальным показателем достоверности более или равным 75. Поиск в списке пептидов для известных мотивов последовательности, указывающих на нейропептиды, принадлежащие к конкретным семействам нейропептидов.
Выберите известную последовательность аминокислот пре-про гормона, представляющую интерес, и используйте TB blast N для поиска по запросу пре-про гормональной последовательности по базе данных. Выберите целевой организм и измените пороговые параметры алгоритма ожидания на 1000, чтобы включить выравнивание низких баллов. Запустите программу blast, а затем проверьте результаты на наличие высоких оценок гомологии между последовательностями запросов и субъектов, что приводит к значительным выравниваниям.
Сохраните файл FASTA, содержащий нуклеотидную последовательность. Переведите пре-про гормональную нуклеотидную последовательность в пре-про гормональные пептидные последовательности с помощью инструмента Expasy translate. Для callinectes sapidus выберите митохондриальные беспозвоночные для генетического кода и запустите инструмент.
Проверьте наличие сигнальных пептидных последовательностей и участков расщепления про-гормона в пептидных последовательностях с помощью сигнала P. Это спектр фрагментации нейропептида, идентифицированный со 100%-ным покрытием последовательности при низкой погрешности массы фрагмента с максимальным пределом 0,02 Дальтона. Вот спектр нейропептида, также идентифицированный со 100% охватом последовательности, но с низким количеством фрагментов ионов, поэтому достоверность идентификации низкая. Это извлеченные ионные хроматограммы для одного нейропептида, который был идентифицирован в двух отдельных и последовательных прогонах.
Несмотря на то, что время удержания немного отличается, его все равно можно использовать для количественной оценки без меток, поскольку сдвиг времени составляет менее одной минуты. Это пример полного спектра сканирования, содержащего нейропептид, который был помечен диметилом, что привело к смещению массы 4,025 Дальтона между легкой и тяжелой формами нейропептида. Массовый спектр фрагментов ионов секвенированного пептида De Novo демонстрирует хорошее покрытие фрагментации, где для каждой аминокислоты наблюдался ион фрагмента B и/или Y с погрешностью низкой массы 0,02 Дальтона.
Это свидетельствует о том, что наблюдался эндогенный пептид, относящийся к семейству нейропептидов ракообразных RYMI. Примеры хороших пятен, которые касаются всех краев гравировки скважины, показаны слева. А примеры плохих пятен показаны справа.
После визуализации MALDI MS нейропептидов из тканей callinectes sapidus были получены изображения распределения ионов различных значений M над Z, соответствующие различным нейропептидам. Оптимизация экстракционного растворителя для конкретного типа анализируемого вещества имеет решающее значение. Также обеспечьте полную гомогенизацию и настройте метод по мере необходимости.
Ничто не будет обнаружено в потоке, если оно не будет извлечено. Этот метод может предоставить основополагающий список важных нейропептидов, которые могут быть дополнительно исследованы в качестве потенциальных биомаркеров, а также предоставить информацию о нецелевой локализации без необходимости в антителах.
