Это простой и быстрый протокол, который позволяет людям, незнакомым с цианобактериями, легко изолировать фикобилисому. Преимущество этой техники в том, что она адаптирована к небольшому масштабу и ее легко выполнить. Это простой, надежный и эффективный метод выделения интактных фикобилисом модельных и немодельных цинобактерий.
Начните с переноса клеточной культуры 0,8 OD при 750 нанометрах в однолитровую колбу и разбавьте ее в 500 миллилитрах среды B-HEPES для достижения OD 0,2 при 750 нанометрах. Выращивайте культуру с постоянным перемешиванием при 30 градусах Цельсия до тех пор, пока OD не достигнет 0,8 к 1, что указывает на позднюю фазу экспоненциального роста. Центрифугируют культуру со скоростью 10 000 г в течение 20 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант.
Суспендировать клетку гранулами и промыть дважды с 0,75 молярным калийфосфатным буфером, рН семь. Гранулируйте ячейки в 50-миллилитровой центрифужной трубке путем центрификации при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки с 0,75 молярным буфером фосфата калия.
Измерьте влажный вес гранулы с помощью электронных весов и повторно суспендируйте один грамм живого веса гранулы в пяти миллилитрах буфера. Добавьте один миллилитр клеточной суспензии и от 0,4 до 0,6 г стеклянных шариков размером 0,1 миллиметра во флакон с двухмиллитровым винтовым колпачком. Разбейте ячейки на 30 секунд бисерным взбителем.
Дайте трубкам остыть на водяной бане комнатной температуры в течение двух минут. После лизиса центрифугируют флаконы в течение 10 секунд при комнатной температуре со скоростью 500 раз в г. Соберите супернатант с пипеткой в 15-миллилитровую центрифужную трубку.
Вымойте шарики 0,5 миллилитрами 0,75 молярного фосфатно-калийфосфатного буфера один раз, затем перенесите в ту же центрифужную трубку. Добавляют Тритон Х-100 к лизированной клеточной суспензии и инкубируют на качающем шейкере при комнатной температуре и 40 об/мин в течение 20 минут или до тех пор, пока раствор не станет однородным. Центрифугировать пробирки в течение 20 минут при 17, 210 раз г и хранить супернатант без верхнего слоя мицеллы тритона при комнатной температуре до одного часа.
Получают четыре концентрации сахарозы в 0,75 молярном буфере фосфата калия при рН семь. Поместите 2,8 миллилитра двух молярных буферов сахарозы на дно 40-миллилитровой центрифужной трубки и наложите три слоя растворов сахарозы. Наконец, добавьте три миллилитра PBS, содержащие фракцию супернатанта, и центрифугируйте полученные градиенты.
После ультрацентрификации конденсируйте фракционированные PBS и фикобилипротеины между слоями и наблюдайте синие полосы в Syn6803 и интерфейсах. Удаляют сахарозу путем многократного концентрирования и разбавления фракций 0,75 молярным буфером фосфата калия и мембраной центробежных фильтрующих блоков. Для измерения флуоресценции PBS разбавляют концентрированный образец PBS молярным буфером фосфата калия 0,75 до объема до 500 микролитров.
Добавьте разбавленный образец PBS в прозрачную стеклянную трубку и заморозьте трубку в жидком азоте до тех пор, пока она полностью не замерзнет. Переместите замороженную трубку в прозрачный контейнер дьюара, предварительно заполненный жидким азотом. Полный лизис клеток показывает надосадочный и темно-сине-зеленый цвет перед центрификацией.
Разделение градиента плотности сахарозы изолированного PBS показывает несколько фракций диссоциированных фикобилипротеинов, а самая низкая фракция представляет собой неповрежденный PBS. Спектры поглощения от диссоциированных и интактных PBS JSC one и Syn6803 имеют одинаковый пик на 622 нанометра, соответствующий фикоцианину. Более того, пик поглощения фикоэритрина составляет 571 нанометр как в диссоциированном, так и в интактном ПБС АО-1.
Спектры излучения диссоциированного PBS имеют один сильный пик примерно в 650 нанометров в Syn6803 и JSC-1, представляющий собой излучение от фикоцианина. Максимальные пики флуоресцентного излучения при 651 нанометре и 684 нанометрах показывают, что энергия, собранная фикоцианином, была эффективно передана аллофикоцианину и концевым излучателям, которые являются ApcD и ApcE, в ядре. На рисунке показано окрашенное цинком SDS-PAGE при УФ-облучении, где фикобилипротеиновые субъединицы сильно флуоресцентны, а ApcE показал слабую флуоресценцию, обозначенную стрелкой.
Синее окрашивание Kumasi показывает, что верхние фракции содержат другие водорастворимые белки, не растворимые в PBS, а неповрежденные PBS и Syn6803 показывают заметную полосу ApcE, обозначенную стрелкой, отсутствующую в диссоциированных фракциях PBS. Ультрацентрифугирование показывает, что градиент сахарозы, полученный в соотношении 1:3, отображает более широкие полосы, чем градиент, сделанный в соотношении 1:10. Важно лизировать клетки и полностью солизолизировать супернатанты, чтобы получить больше фикобилисом.
Другие методы, такие как крио-ЭМ или смешанная спектрометрия, могут быть использованы для изучения структуры белка или белкового состава фикобилисом.
