Этот протокол важен, потому что успешная работа с органоидами заключается в деталях, и в этой области отсутствуют четкие подробные протоколы для других. Самым большим преимуществом этого метода является временная шкала, низкие требования к биомассе и низкая стоимость масштабируемости. Хотя требуется гораздо больше работы, этот метод может помочь улучшить лечение рака легких, позволяя тестировать более точные индивидуальные или комбинированные методы лечения, которые могут быть переведены клинически.
Самая большая проблема связана с обработкой BME2, широко известного как Matrigel. Я настоятельно рекомендую практиковать пипетку и обработку жидкости BME2 перед введением ваших драгоценных органоидов. Начните с диссоциации погруженной органоидной культуры BME2 путем тщательного аспирации среды из культуральных пластин, избегая прикосновения к культуре.
Трипсинизируют погруженную органоидную культуру BME2 подходящим рекомбинантным ферментом, добавляя два миллилитра рекомбинантного фермента на скважину в шестилуночной пластине. Механически разрушайте BME2 путем многократного пипетирования вверх и вниз и инкубируйте пластины при 37 градусах Цельсия в инкубаторе клеточной культуры в течение пяти минут. В конце инкубации переместите суспензию в 15-миллилитровую центрифужную трубку и центрифугу в 600 раз больше G в течение пяти минут при комнатной температуре.
Аспирировать рекомбинантный фермент-супернатант осторожно, не прикасаясь к органоидной грануле, и повторно суспендировать органоидную гранулу в питательной среде. После добавления ДНКазы 1 инкубируют суспензию в течение пяти минут при комнатной температуре и центрифугируют в 600 раз г в течение трех минут при комнатной температуре. Осторожно выбрасывайте среду, не касаясь органоидной гранулы, и повторно суспендируйте гранулу в свежей питательной среде.
Разогрейте новую черную чистую нижнюю 96-луночную пластину при 37 градусах Цельсия в инкубаторе клеточной культуры в течение 10 минут, затем подготовьте клеточную суспензию в PBS для подсчета клеток с помощью клеточного анализатора. После расчета объема клеточной суспензии, необходимого для эксперимента, аликвотирует клетки из одноэлементной суспензии и гранул вниз путем центрифугирования, как показано ранее. Как только среда будет выброшена, держите клетки на льду в течение примерно одной минуты перед повторным использованием в BME2.
Наклоните предварительно нагретую черную чистую нижнюю 96-луночную пластину в сторону тела и засейте пять микролитров клеточной суспензии на лунку с последующим посевом клеточных куполов в шестичасовом положении колодца. Заполните наружные колодцы на краю плиты 96 скважин PBS и засейте купола ячейки в оставшихся внутренних скважинах. Инкубируйте свежепосеянные клеточные купола в ламинарной вытяжке клеточной культуры в течение пяти минут, не перемещая пластину, затем переложите пластину в инкубатор клеточной культуры для инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут.
Осторожно добавьте 100 микролитров питательной среды на скважину ко всем скважинам, содержащим органоиды, и 100 микролитров PBS к наружным колодцам на краю пластины. Культивируйте органоиды при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи дней, меняя среду в соответствии с указаниями, упомянутыми в текстовой рукописи, регулярно проверяя рост органоидов под световым микроскопом. Приготовьте серийное разведение препарата в средах с низким фактором роста для осимертиниба для лечения EGFR мутантных немалоклеточных органоидов рака легкого.
Включите отрицательный контроль, добавив носители с низким фактором роста и 0,1% DMSO. Поверните органоидную пластину по часовой стрелке на 180 градусов так, чтобы органоиды теперь находились в положении «12 часов», и осторожно аспирировать среду роста с помощью многоканального аппарата предпочтительно. Добавьте 100 микролитров контрольного или лекарственного раствора на лунку.
Снова инкубируйте обработанные органоиды при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе клеточных культур в течение пяти дней. Начните выполнять анализ на выживание, разморозив реагент на ночь при четырех градусах Цельсия. Уравновешивают реагент на водяной бане комнатной температуры в течение 30 минут перед использованием и перемешивают путем инвертирования.
Добавьте 100 микролитров реагента в каждую лунку и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз наконечником пипетки, расположенным в положении органоидного купола. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре в темное время суток. Используя многоканальную пипетку, переложите приблизительно 150 микролитров лизата на новую белую непрозрачную нижнюю 96-луночную пластину, а затем инкубируйте пластину в течение дополнительных 25 минут при комнатной температуре в темноте.
Запись люминесценции с помощью считывателя пластин ИФА. Сохраняйте данные в соответствующем формате таблицы данных, содержащей все необработанные чтения и записи макета пластины и используемых лекарств. EGFR-мутантные органоиды TH107 показали чувствительность к лечению осимертинибом с половинной максимальной ингибирующей концентрацией 56 наномоляров, тогда как EGFR-мутантные положительные органоиды TH116 были устойчивы к лечению осимертинибом с половинной максимальной ингибирующей концентрацией более одного микромоляра.
Чувствительность EGFR-положительных TH107 немалых клеток рака легких сопровождалась значительными транскрипционными изменениями, включая снижение экспрессии сигнатур генов, связанных с клеточным циклом, и увеличение экспрессии апоптоз-ассоциированной генной сигнатуры. Реакция чувствительного EGFR-мутантного положительного TH330 на целевые ингибиторы значительно влияет в средах роста по сравнению со средами с низким фактором роста. Комбинаторное лечение EGFR-мутантным TH330 приводило к увеличению ответа на лечение.
Этот подход улучшает персонализированные стратегии молекулярной терапии или комбинаторных схем лечения. Последнее помогает нацеливаться на механизмы лекарственной толерантности и резистентности на ранней стадии для углубления клинического ответа и улучшения результатов лечения пациентов.
