Этот протокол важен, потому что он позволяет определять экспрессию генов у старых личинок рыбок данио и молоди во время метаморфоза. Преимущество этой методики заключается в том, что было оптимизировано несколько шагов для проникновения зонда и визуализации почки. Для начала настройте взрослых рыбок данио на спаривание, добавив одного самца и одну самку рыбы в брачный резервуар во второй половине дня после их последнего приема пищи.
На следующий день соберите эмбрионы в пластины Петри, содержащие среду Е3. Через пять дней после внесения удобрений поместите 400-микрометровый экран в 2,8-литровый бак и заполните его 2 сантиметрами системной воды. Затем добавьте личинку из одной пластинки Петри.
Чтобы закрепить личинку, снимите резервуар с личинкой в нужный момент времени, затем, используя сеть и перенесите пипетку с отрезанным кончиком, перенесите личинку на пластину Петри. Затем добавьте два миллилитра 2% трикаина, чтобы обездвижить личинку. После иммобилизации замените трикаин 20 миллилитрами фиксирующего раствора.
Через 30 минут переведите личинку в 50-миллилитровую трубку, содержащую 25 миллилитров свежего фиксирующего раствора. Затем, убедившись, что колпачок плотный, медленно раскачивайте трубку при четырех градусах Цельсия в течение двух дней. На третий день замените фиксирующий раствор 20 миллилитрами PBST, а затем перенесите личинку на пластину Петри.
Чтобы измерить личинку, поместите пластину Петри поверх плоской линейки под рассекающим микроскопом, затем, используя манипулятор ресниц, переместите каждую личинку на линейку, чтобы измерить ее общую длину. После измерения всех личинок соедините несколько личинок одинаковой длины на одном стеклянном флаконе с PBST объемом 5,5 миллилитра. При обезвоживании замените ПБСТ в стеклянном флаконе четырьмя миллилитрами 100% метанола, затем храните флакон при минус 20 градусах Цельсия в течение двух дней.
Для регидратации замените 100% метанол четырьмя миллилитрами 75% метанола и 25% раствора PBST и покачайте флакон в течение пяти минут. Затем замените раствор метанола и ПБСТ четырьмя миллилитрами свежего ПБСТ и снова раскачивайте флакон в течение 10 минут. Для переваривания протеиназы К замените ПБСТ двумя миллилитрами раствора протеиназы К и раскачивайте флакон при комнатной температуре в течение 30 минут.
Далее для отбеливания переложите личинку на шестилуночную пластину и замените ПБСТ тремя миллилитрами свежего отбеливающего раствора. После полного исчезновения пигментации вдоль мезонефроса переложите личинку обратно в стеклянный флакон, замените отбеливающий раствор четырьмя миллилитрами ПБСТ и прокачайте флакон в течение 10 минут. Для предварительной гибридизации замените фиксирующий раствор четырьмя миллилитрами PBST и покачайте флакон в течение 10 минут, затем замените PBST четырьмя миллилитрами Hyb-раствора и породы в течение 10 минут.
После двух дополнительных инкубаций в Hyb-растворе заменить раствор четырьмя миллилитрами раствора Hyb+. Одновременно разбавьте флуоресцеиновый зонд EGFP от одного до 100 в 500 микролитрах гибридизации плюс раствор и инкубируйте флакон и зонд при 70 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день, чтобы гибридизировать зонд, замените раствор Hyb+ во флаконе предварительно нагретым зондом и инкубируйте при 70 градусах Цельсия в течение ночи.
На следующий день добавьте 50 миллилитров предварительно нагретого 0,2 раза SSCT в 50-миллилитровую трубку. Затем вставьте 100-микрометровый клеточный ситечко в верхнюю часть трубки, перенесите личинку из стеклянного флакона в клеточный ситечко и, убедившись, что личинка погружена в буфер, инкубируйте флакон при 70 градусах Цельсия в течение двух часов. После инкубации перенесите клеточный ситечко в новую трубку, содержащую предварительно нагретый 0,2 раза SSCT, и снова инкубируйте при 70 градусах Цельсия в течение двух часов.
Далее для блокировки переложите личинку в новый стеклянный флакон и дайте ему остыть до комнатной температуры. Затем замените 0,2-кратный раствор SSCT четырьмя миллилитрами 67%0,2-кратного раствора SSCT и 33%-го раствора MABT и покачайте флакон при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем замените раствор SSCTT MABT четырьмя миллилитрами свежего MABT и инкубируйте флакон на коромысле в течение 10 минут.
Затем замените MABT четырьмя миллилитрами блокирующего раствора и высиживайте четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день замените блокирующий раствор раствором антител и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение двух дней. Для промывки антител переложите личинку в 50-миллилитровую трубку, затем добавьте 40 миллилитров PBST2 и положите трубку, лежащую на бок для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия.
На 12-й день, после переноса лавы на шестилуночную пластину, замените PBST2 тремя миллилитрами буфера окрашивания. После пятиминутной инкубации на коромысле замените буфер окрашивания тремя миллилитрами окрашивающего раствора. Когда желаемая интенсивность окрашивания достигнута, замените окрашивающий раствор тремя миллилитрами стопорного раствора и камня на 30 минут.
Затем переложите личинку в новый стеклянный флакон, замените остановочный раствор четырьмя миллилитрами свежего фиксирующего раствора и высиживайте в течение одного часа при комнатной температуре. Для визуализации замените фиксирующий раствор четырьмя миллилитрами свежего ПБСТ. После 10-минутной инкубации на коромысле переложите личинку на шестилуночную пластину, затем замените PBST четырьмя миллилитрами свежего PBST и снова покачайте пластину в течение 10 минут.
Далее добавляют три миллилитра 50% глицерина в ПБСТ и породу в течение 10 минут, затем, используя рассекающий микроскоп, визуализируют личинку непосредственно в шестилуночной пластине. Этот протокол гибридизации in situ эффективно маркирует клетки-предшественники почек и различные нефронные структуры, используя развитие мезонефроса. Начальный мезонефрический нефрон образуется примерно на 5,2 миллиметра дорсально к пронефру.
Кластеры клеток-предшественников присутствуют во время развития мезонефроса в дополнение к одиночным клеткам-предшественникам. У более крупных молодых особей фоновое окрашивание может происходить в сомитах. В целом, этот метод может быть использован для изучения других тканей, которые образуются во время метаморфоза, помимо рассеченных взрослых органов.
