Исследование большей популяции сопровождается машинной вариацией, которая, таким образом, является фактической вариацией, происходящей из природного разнообразия. Здесь мы демонстрируем метод уменьшения технических вариаций для последующего анализа интеграции. К преимуществам данного метода относится экстракция на основе разделения лица, обеспечивающая анализ различных метаболитов на соответствующей аналитической платформе, при одновременном устранении системной ошибки и сохранении биологической дисперсии.
Как только генотипическая и фенотипическая информация получена, этот метод может быть применен к любому разнообразному естественному населению в любом царстве жизни. Для начала берут 20-миллилитровые уборочные трубки, добавляют два пятимиллиметровых и два металлических шарика диаметром восемь миллиметров для гомогенизации и маркировку трубок. Затем заполните дьюар жидким азотом, сразу после обрезки соберите свежие образцы листьев и корневых тканей в жидком азоте путем мгновенной заморозки.
Храните собранные биологические образцы при температуре 80 градусов цельсия для дальнейшей обработки. Предварительно охладите держатели трубок жидким азотом. Далее измельчаем ткани при 25 герцах в течение одной минуты до получения однородного порошка.
Повторите замораживание и измельчение, если ткань не однородно измельчена. Взвесьте 50 миллиграммов свежего растительного материала в предварительно охлаждаемых двухмиллиметровых микроцентрифужных трубках с безопасным замком, гарантирующих, что растительный материал остается замороженным во время процесса взвешивания. Добавьте один миллилитр предварительно охлажденной экстракционной смеси от 1 до 50 миллиграммов аликвоты образца и кратковременно вихните трубку, прежде чем держать на льду.
Инкубируйте образцы на орбитальном шейкере в 800 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, а затем обрабатывайте ультразвуком в охлаждаемой льдом ванне для обработки ультразвуком в течение 10 минут. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 500 микролитров экстракционной смеси в образцы и перемешать экстракты путем короткого вихря, затем центрифугировать смесь в 11, 200 раз G в течение 5 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования перенесут 500 микролитров отделенной верхней липидсодержащей фазы в предварительно маркированную 1,5-миллилитровую безопасную блокировочную микроцентрифужную трубку, удаляют остальную часть верхней фазы.
В отдельных, 1,5-миллилитровых безопасных запорных микроцентрифужных трубках передают 150 микролитров нижней полуполярной фазы четыре GCMS и 300 микролитров полуполярной фазы четырех U-H-P-L-C MS анализа. Используйте вакуумный концентратор для выпаривания растворителя, чтобы сконцентрировать все экстрагированные фракции без нагревания и хранить высушенные фракции при 20 градусах Цельсия. Для подготовки образца к сверхвысокой производительности жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии или H-P-L-C MS повторно суспендируют высушенные полуполярные фракции в 180 микролитрах смеси метанола и воды.
Затем обрабатывают ультразвуком полуполярную фазу в течение 2 минут с последующим центрифугированием в 11, 200 раз G в течение одной минуты. После центрифугирования переложите 90 микролитров супернатанта в стеклянный флакон и введите два микролитра экстрактов в разлитый образец LCMS. Выполняют фракционирование метаболитов на перевернутой колонне фазы С18, удерживаемой при 40 градусах Цельсия, и потоке 400 микролитров в минуту с постепенным изменением сточных вод А и В, получают масс-спектры исследуемой заготовки и контроль качества образцов в режиме отрицательной ионизации с диапазоном масс 102 1500 масс к заряду.
Для полуполярных образцов метаболитов запустите объединенный образец QC в зависимой от данных тандемной масс-спектрометрии в отрицательном и положительном режимах ионизации. Используйте полученные масс-спектры для аннотации. Выполните нормализацию набора данных, проверив распределение внутреннего стандарта.
Нормализуйте данные, корректируя для сигнала один или несколько внутренних стандартов. Затем скорректируйте пиковые интенсивности, полученные из хроматограммы, по точному весу образца. Для коррекции дрейфа интенсивности между многосерийными сериями выполните методы коррекции на основе КК, такие как локально оцененное сглаживание диаграммы рассеяния с использованием R.Перед выполнением общегеномных ассоциативных исследований или GWAS отфильтруйте генотипические данные для второстепенных частот аллелей менее 5% и отсутствующей частоты более 10% с использованием кисточки.
Это позволит избежать низкочастотного смещения. Чтобы устранить смещение, возникающее из-за факторов окружающей среды, используйте пакет R LME four и рассчитайте лучшие линейные, непредвзятые прогнозы или блочки для каждого нормализованного признака по сравнению с экспериментальными повторениями. Используйте капли каждого признака по отдельности для выполнения GWAS с пакетом rMVP в R.Липидомические данные по нескольким распространенным видам бобов показаны на основе необработанных базовых пиковых хроматограмм двух образцов QC из разных партий.
Наблюдалось изменение интенсивности сигнала для определенных классов липидов. Системная ошибка была более очевидной, когда анализ основных компонентов выполнялся на необработанных данных. Процедура нормализации, включая локально оцененное сглаживание диаграммы рассеяния, привела к кластеризации образцов QC.
При рассечении на отдельные кластеры машинные ошибки в седьмой и восьмой партиях стали очевидными до нормализации, которая была исправлена. Постнормированные и трансформированные отдельные метаболомические кластеры использовались для GWAS, получая несколько ассоциаций маркеров признаков. В репрезентативном анализе различные классы соединений выделены разными цветами, в то время как маркеры, связанные с несколькими классами соединений, обозначены его ближайшим геном.
Нормализация и преобразование данных являются одним из наиболее важных шагов. Убедитесь, что была выполнена надлежащая коррекция для исправления системной ошибки, и обеспечьте нормальность распределения. Выполняя коррекцию аналитической вариации, можно выполнить несколько интеграционных подходов, таких как метаболический корреляционный анализ и интеграция в феномические данные, чтобы пролить свет на сложные признаки.
