Наш протокол предоставляет нам возможность изучать устойчивые к антибиотикам бактерии в пищевой и физической среде, аналогичной тому, как они, вероятно, существуют in vivo. Одним из самых больших преимуществ этого метода является возможность захвата изображений с высоким разрешением и фенотипических данных бактерий в популяциях, соответствующих инфекции. Это агрегаты примерно от 10 до 1000 клеток.
Продемонстрировать процедуру будет Алекса Гэннон, аспирант из моей лаборатории. Для начала стерилизуйте муцинсодержащую среду под ультрафиолетовым светом в течение четырех часов. Переложите обработанный УФ-излучение муцин в стерильные 1,7-миллилитровые трубки в стерильных условиях и храните пробирки при минус 20 градусах Цельсия.
После приготовления буферного основания добавляют запасной раствор муцина в буферное основание, содержащее ДНК, как описано в текстовой рукописи. Вечером перед экспериментом привите пять миллилитров бульона LB несколькими колониями Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 из антибиотика, содержащего пластину агара LB, и культивируйте бактерии на ночь при 37 градусах Цельсия с перемешиванием при 250 оборотах в минуту. На следующее утро, по крайней мере, за два часа до начала эксперимента, включите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп и откройте инкубационный модуль в соответствующем программном обеспечении для визуализации.
Развести 500 микролитров культуры в пяти миллилитрах свежего бульона LB и инкубировать бактериальную суспензию при 37 градусах Цельсия и 250 оборотах в минуту в течение 60-90 минут. Когда бактерии воходят в фазу журнала, гранулируйте бактериальные клетки центрифугированием и трижды промывайте клетки фильтрующим стерилизованным PBS. После последней промывки повторно суспендируют гранулу в одном миллилитрах PBS.
Измерьте поглощение суспензии бактериальных клеток на 600 нанометрах, чтобы определить объем культуры, необходимый для оптической плотности 0,05 в пяти миллилитрах синтетической среды мокроты муковисцидоза два. Аккуратно привить рассчитанный объем суспензии бактериальных клеток в среде и вихрь, прежде чем добавить по одному миллилитру клеток в каждую камеру четырехкамерной оптической культуральной чашки, затем инкубировать бактерии в течение четырех часов в статических условиях при 37 градусах Цельсия. Для получения изображения агрегатов Pseudomonas aeruginosa конфокальным лазерным сканирующим микроскопом в конце инкубации назначают три скважины культуральной пластины в качестве реплик лечения антибиотиками и одну хорошо, как контроль без лечения, и помещают пластину на нагретую стадию в микроскоп.
Выберите цель погружения масла 63X и откройте вкладку «Местоположение», чтобы определить бактериальные агрегаты в ярком поле. Определите область для визуализации в каждой скважине и используйте модуль позиций для хранения положения области. Установите длину волны возбуждения на 488 нанометров, а длину волны излучения на 509 нанометров.
В модуле сбора выберите опцию Z-стек для получения изображений и используйте модуль усреднения линий для уменьшения фоновой флуоресценции в канале GFP в пределах общего объема изображений Z-стека. Установите параметр временного ряда для захвата 60 срезов в каждой скважине с 15-минутными интервалами в течение 18 часов и используйте определенную стратегию фокусировки для хранения фокальной плоскости для каждой позиции, которая будет повторно визуалироваться в каждый момент времени на протяжении всего эксперимента. Через 4-1/2 часа после начала эксперимента по визуализации визуализируйте каждую позицию, чтобы определить совокупную биомассу в каждой из четырех скважин до добавления антибиотика.
Через шесть часов осторожно добавьте антибиотик в два раза ниже минимальной ингибирующей концентрации в середину каждой скважины, просто продуйте воздушную жидкую интерфейс и нажмите начать эксперимент, чтобы начать визуализацию после лечения антибиотиками. Чтобы изолировать живые клетки, в конце 18-часового периода визуализации маркируют бактерии в каждой скважине соответствующим объемом йодида пропидия в соответствии с рекомендациями производителя. В конце инкубации используйте изолированный контейнер для переноса пластины на проточный цитометр и установите цитометр для обнаружения GFP и йодида пропидия с использованием 70-микронной сопла, затем запустите один миллилитр аликвоты каждого супернатанта культуры с наименьшей скоростью потока для сортировки жизнеспособных GFP-положительных и нежизнеспособных агрегатов Pseudomonas aeruginosa отрицательных пропидия йодида.
Чтобы количественно оценить совокупную динамику, загрузите изображения в соответствующую программу для анализа изображений и создайте гистограммы подсчетов, полученных для необработанных контрольных и обработанных антибиотиками культур в канале GFP, чтобы обеспечить количественную оценку фоновой флуоресценции. Чтобы убедиться, что обнаруженные вокселы GFP коррелируют с бактериальной биомассой, определите GFP-положительный воксель как более или равный в 1,5 раза значению фонового количества GFP. Создайте поверхности ISO для всех оставшихся вокселов и для обнаружения отдельных агрегатов включите параметр разделения объектов и определите агрегаты как объекты.
Используйте модуль vantage для расчета объема XYZ и суммы вокселей GFP для каждого отдельного объекта. Экспортируйте эти данные на внешнюю статистическую платформу. Фильтрация экспортируемых данных по размеру для определения объектов с объемами, превышающими или равными пяти кубическим микрометрам.
Удалите все объекты размером менее 0,5 кубических микрометров и используйте модуль vantage для расчета расстояния до каждого объекта по отношению к другим объектам в пределах каждого изображения. Альтернативно, расстояние может быть рассчитано с использованием формулы, затем использовать сумму и средние расчеты для определения общей биомассы в среднем совокупном объеме. Хотя после четырех часов применения антибиотиков остаются множественные жизнеспособные бактериальные агрегаты, общая биомасса совокупных популяций в культурах, обработанных антибиотиками, значительно снижается по сравнению с биомассой необработанных культур.
Микроскопия временных рядов может быть использована для определения пространственных паттернов между чувствительными положительными пропидий-йодидами и толерантными GFP-положительными агрегатами после лечения антибиотиками. Вычисляя, как агрегаты разных размеров вносят вклад в общую популяцию, можно определить закономерности того, как агрегаты реагируют на лечение антибиотиками по отношению к их размеру, форме и положению. После лечения антибиотиками жизнеспособные и нежизбивные агрегаты могут быть успешно разделены в соответствии с их флуоресцентной экспрессией сигнала.
Мы надеемся, что этот протокол вдохновит других исследователей на изучение их организма по выбору с аналогичным разрешением. Наша цель состоит в том, чтобы найти общие биологические нити в этих сложных сообществах независимо от места заражения.
