Установка XChem в Diamond Light Source обеспечивает регулярный крупномасштабный скрининг кристаллических графических фрагментов, поддерживая весь процесс осаждения кристаллов. Рентгеновская кристаллография является неотъемлемой частью инструментария FBDD. Он достаточно чувствителен для идентификации слабых связующих веществ и непосредственно дает структурную информацию о взаимодействиях на молекулярном уровне.
Поиск лекарств на основе фрагментов является широко используемой стратегией для обнаружения свинца. Компания поставила шесть препаратов для клинического использования, и более 50 молекул были доведены до клинических испытаний. Влияние достижений и эффективности, обеспечиваемых платформой XChem, по сравнению с традиционными методами замачивания, сбором данных и методами анализа лучше всего продемонстрировано визуально.
Начните с выбора кристаллов и расположения соединений. Откройте TextRank на ПК и выберите лоток для кристаллов из списка в правом нижнем углу или введя штрих-код в поле в левом верхнем углу. Выберите правильный формат изображения и вид одной скважины.
Чтобы добавить растворитель или соединения в каплю, не задев кристалл, щелкните правой кнопкой мыши внутри капли, но в стороне от кристалла, когда подходящий кристалл для эксперимента будет найден при перемещении по изображениям капли. Откройте программное обеспечение Echo и выберите новое для дозирования растворов с помощью акустического диспенсера. Выберите правильную скважину и класс жидкости.
Убедитесь, что в качестве целевой пластины выбран правильный тип пластины. Затем установите флажок и продолжите. Выберите импорт и выберите соответствующий пакетный файл.
Затем выполните действия по импорту в соответствии с запросами программного обеспечения. Используйте карты пластин, чтобы проверить раствор, который нужно выдать, и места назначения. Затем запустите протокол, следуя подсказкам по мере их появления.
Растворы из исходной пластины будут распыляться в выбранные кристаллические капли. Храните пластину в инкубаторе необходимое время. Чтобы собрать кристаллы с помощью полуавтоматического устройства для сбора кристаллов, нажмите кнопку запуска рабочего процесса, чтобы перейти к первому выбранному положению скважины.
Если кристалл уцелел, вмонтируйте его в петлю и погрузите в жидкий азот, поставив на позицию один в первой шайбе в списке. Выберите подходящее описание кристалла в интерфейсе. Если капля является составной для замачивания, запишите описание состояния соединения.
Если кристалл был успешно смонтирован, выберите mounted, в противном случае выберите fail. После того, как кристаллы будут собраны, отнесите шайбы к сканеру штрих-кодов и поместите их в держатель по одной, чтобы отсканировать шайбу и закрепить штрих-коды. После завершения сканирования наденьте крышки на шайбы и храните их в хранилище Дьюара для хранения жидкого азота.
Чтобы вспомнить смещенные выборки, посмотрите на представление устройства смены выборок в ISPyB и выберите ранжирование по разрешению точки доступа, чтобы оценить выборки по автоматически обработанному разрешению в цветовой градации от зеленого до красного. Нажмите на образцы, чтобы проверить наличие красных или желтых образцов. Затем проверьте снимки кристалла, чтобы увидеть, был ли кристалл центрирован.
Чтобы получить и проанализировать результаты автоматической обработки Diamond с помощью XChem Explorer или XCE, в терминале перейдите в подпапку processing и используйте псевдоним XCE для открытия XChem Explorer. Нажмите кнопку Обновить таблицы из источника данных на вкладке Обзор, чтобы обновить сводку экспериментальных данных. На вкладке настроек выберите каталог сбора данных, откройте вкладку наборы данных.
Выберите целевой объект в раскрывающемся меню выбора целевого объекта, выберите Получить новые результаты автоматической обработки в раскрывающемся меню наборов данных и нажмите кнопку Выполнить. Чтобы рассчитать исходные карты с помощью Dimple, откройте вкладку maps, выберите опорную модель из выпадающего меню и выберите нужные наборы данных, после чего запустите Dimple для выбранных файлов MTZ. Чтобы создать ограничения лигандов, выберите нужные наборы данных, а затем создайте файл SCF, PDB или PNG выбранных соединений из раскрывающегося списка карт и ограничений.
Чтобы определить хиты с помощью Panda, выберите вкладку Pandas, убедитесь, что выходной каталог определен правильно, и запустите panda. Анализируйте из выпадающего меню идентификации хитов. Чтобы проанализировать хиты, выявленные Panda, запустите panda.
Выполните проверку в раскрывающемся меню Идентификация хитов. Открыть Coot с помощью панели управления Panda. Загрузите усредненные и 2mFo-DFc карты из Dimple для сравнения с картой событий и моделью.
После того, как лиганд был установлен, нажмите на слияние лиганда с моделью и сохраните модель, прежде чем переходить к другому событию, чтобы избежать потери каких-либо изменений в модели связанного состояния. Аннотируйте событие привязки с помощью поля комментария к событию и аннотируйте сайты привязки, используя сведения о сайте записи. После того, как все жизнеспособные лиганды будут смоделированы, объединены и сохранены на основе карты событий, закройте panda.inspect.
Экспортируйте модели проверки Panda обратно в каталог проекта и запустите начальный раунд уточнения для выбранных наборов данных, и теперь уточнение будет видно на вкладке уточнения. Конвейер XChem для скрининга фрагментов с помощью рентгеновской кристаллографии был значительно оптимизирован, что позволило научному сообществу принять его. Эта диаграмма демонстрирует внедрение и консолидацию пользовательской программы с 2015 по 2019 год с созданием групп распределения блоков в 2019 году и устойчивостью платформы во время пандемии COVID-19 в 2020 году.
Успешные кампании дают трехмерную карту потенциальных сайтов взаимодействия с целевым белком. Типичным результатом является XChem-скрининг основной протеазы SARS-CoV-2. Известные участки, представляющие интерес, такие как активные центры ферментов и подкарманы, показаны желтым цветом.
Предполагаемые аллостерические сайты, такие как те, которые участвуют в белок-белковых взаимодействиях, показаны пурпурным цветом, а интерфейсы упаковки кристаллов, обычно считающиеся ложноположительными, показаны зеленым цветом. Исторически сложилось так, что использование кристаллографии в качестве первичного фрагментного экрана было затруднительным. В этом исследовании были задокументированы протоколы конвейера XChem от подготовки образцов до конечных структур.
Кристаллографический скрининг фрагментов дополняет другие биофизические методы и, как правило, необходим для прогрессирования попаданий фрагментов в соединения свинца. Он может быть применен к любому мишени для разработки лекарств.
