Это новый протокол без литографии для моделирования 3D-кожи на чипе с использованием микрообрабатываемых, клейких виниловых слоев и методологии параллельного потока для генерации дермального компартмента. Микрообработанный винил обеспечивает большую простоту в процессе изготовления и универсальность в компоновке устройства, преодолевая некоторые ограничения PDMS и традиционных подходов к литографии. Эта многослойная кожа на чипе может быть использована для лекарственных и косметических подходов к тестированию, поскольку она позволяет проводить высокопроизводительный скрининг при меньших затратах и может быть использована для моделирования нескольких заболеваний.
Начните с разработки микрофлюидного чипа с помощью программного обеспечения Brother Canvas Workspace. Создайте рабочее пространство размером 30 на 30 сантиметров и заполните его шаблонами проектирования для различных слоев чипа, прежде чем хранить его в файле svg. Вырежьте виниловые листы 30 на 30 сантиметров.
Приклейте его к низкоклему клейкому коврику и при необходимости удалите все пузырьки воздуха. Используя USB-накопитель, загрузите файл svg в плоттер кромки и установите параметры резания: давление резания на нулевом уровне, режущее лезвие на третьем уровне и первый уровень для скорости резания. Когда параметры будут установлены, поместите клеевой коврик с винилом в плоттер и начните процесс резки узоров канала на виниле толщиной 95 микрометров.
Соберите все устройство с помощью элайнера для правильной регулировки каналов, входов и розеток. Нагромождение для виниловых слоев с соответствующей конструкцией микромашины для сборки нижнего канала, сохраняя ленту крышки нижнего слоя, чтобы избежать прилипания к элайнеру. Вырежьте и поместите поликарбонатную пористую мембрану поверх нижнего канала, не закрывая входы.
Добавьте 10 виниловых слоев с конструкцией верхней камеры и наклейте сверху двусторонний конечный слой ленты. Извлеките чип из элайнера, чтобы наклеить его на стеклянную горку. Поместите лист PDMS толщиной в два миллиметра поверх двустороннего винилового слоя ленты.
Чтобы убедиться, что чип полностью водонепроницаем, оставьте вес поверх чипа на ночь. На следующий день стерилизуйте чипс, промыв его 70% этанолом в течение пяти минут, после чего промывку дистиллированной водой. Подключите насос один и насос два к верхнему входу камеры один и верхнему входу камеры два, соответственно.
Подключите третий насос к входу в нижнюю камеру, затем подключите верхнюю камеру и выходы нижней камеры к отработанной ванне. Подключите шприцы к каждому входу с помощью трубок из PTFE и разъемов из нержавеющей стали 18 калибра. Насос PBS с насосом три через вход в нижнюю камеру со скоростью 50 микролитров в минуту, а с насосом два через входную верхнюю камеру два со скоростью 100 микролитров в минуту.
Затем загрузите шприц предварительным гелем фибриногена, сразу же поместите его в насос и запустите его со скоростью 200 микролитров в минуту. Как только предварительный гель выйдет из верхней камеры, остановите насосы один и два, затем, не снимая трубку, оставьте чип, чтобы обеспечить гелляцию при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. После геллации заблокируйте верхний вход камеры крышкой и прокачайте культурную среду через входную в верхнюю камеру два с помощью насоса три со скоростью 50 микролитров в час в течение ночи.
Через 24 часа после генерации кожного компартмента проверьте, что клетки первичных фибробластов человека распределены в сборке, затем введите пять раз по 10 до 6 ГКК на миллилитр через верхний входной канал два со скоростью 40 микролитров в минуту в течение одной минуты. Для прикрепления клеток поместите чип на ночь при температуре 37 градусов цельсия в инкубаторе, насыщенном влажностью. Начинайте перекачивание свежей питательной среды с помощью насоса три только через вход в нижнюю камеру со скоростью 50 микролитров в минуту.
В репрезентативном анализе отображается высота гидрогеля вдоль верхней камеры сборки. Средняя высота 550 микрометров была оптимальной для функционирования геля при скорости потока 100 и 200 микролитров в минуту для жертвенного PBS и пре-геля соответственно. Неспособность промыть PBS через нижний канал привела к расхождениям между теоретической высотой геля и измеренной, с разницей в 40% Через 24 часа от начала протокола параллельного потока было обнаружено, что первичные фибробласты человека успешно распространяются в фибриновом геле в верхней камере сборки, после чего зеленые флуоресцентные белково-экспрессивные ГКК могут быть эффективно посеяны поверх гидрогеля.
Удаление трубки без удержания системы закрытой в течение ночи, чтобы позволить HKCS отстойнику, привело к неоднородному, сливательному монослою клеток. 3D-конфокальный анализ недифференцированной модели кожи в микрофлюидном чипе ясно показал поверхность гидрогеля, отделяющего ГКК в верхней части от фибробласта, встроенного внизу. Сгенерированная кожа может подвергаться воздействию воздушно-жидкого интерфейса для получения зрелого и дифференцированного эпидермиса и далее характеризоваться с использованием нескольких кожных и эпидермальных маркеров.
Этот метод позволяет быстрее и дешевле изготовить устройства, а также создать многослойную кожу с использованием микрофлюидики, обеспечивая более реалистичный подход к тестированию лекарств и косметики.
