Этот протокол может быть использован для получения инкапсулированных липидных наночастиц нуклеиновых кислот с высокой воспроизводимостью и скоростью и низкими объемами. Параметры состава могут быть настроены для достижения желаемого биораспределения на основе клинического применения. Стандартная конструкция картриджа «елочка» обеспечивает быстрый, точный и контролируемый ламинарной поток во время перемешивания.
Метод поддается масштабированию и генерирует однородные, высокоинкапсулированные частицы. Поскольку большинство коммерчески одобренных продуктов генной терапии полагаются на вирусные методы, эта процедура может дать представление о доставке генов, поскольку ее невирусный подход позволяет использовать приложения, для которых необходимо повторное дозирование. Начните с добавления соответствующего количества каждого жидкого раствора в стеклянный флакон с прерывистым вихрем.
как указано в таблице, с последующим добавлением 200 пробного этанола к конечному объему в 533 микролитра. Затем добавляют соответствующее количество запаса мРНК и разбавляют цитратным буфером для достижения конечного объема в 1,5 миллилитра при желаемой концентрации. Чтобы загрунтовать микрофлюидные каналы, сначала введите параметр грунтовки в программное обеспечение прибора, как указано в таблице.
Затем откройте крышку прибора и поместите микрофлюидный картридж во вращающийся блок. Загрузите не менее 500 микролитров этанола в шприц размером 1 миллилитр, позаботясь о том, чтобы на кончике шприца не было пузырьков или воздушных зазоров, и вставьте шприц в правое отверстие картриджа. Загрузите пятимиллилитровой шприц с 1,5 миллилитрами цитратного буфера, заботясь о том, чтобы не было пузырьков воздуха или зазоров, и вставьте шприц в левое впускное отверстие картриджа.
Поместите две конические трубки по 15 миллилитров в держатели зажимов, чтобы они служили контейнерами для отходов, и нажмите кнопку «Перейти», чтобы смешать растворы. Когда инструмент перестанет грунтовать, как указано отключением нижнего синего света, откройте поздний и правильно утилизируйте конические трубки и шприцы. Для образования липидных наночастиц устанавливают соответствующие параметры состава, как указано в таблице, и нагружают шприц 1 миллилитр предварительно приготовленной липидной смесью.
Удалите воздушные зазоры или пузырьки в наконечнике шприца и вставьте шприц в правую сторону картриджа. Загрузите предварительно приготовленный раствор нуклеиновой кислоты в шприц 3 миллилитра, позаботясь о том, чтобы в наконечнике шприца не было пузырьков или воздушных зазоров, и вставьте шприц в левое отверстие картриджа. Поместите 15-миллилитровую коническую трубку без РНКАазы, помеченную именем образца, в левый зажим трубки и поместите 15-миллилитровый конический отработанный конический в правый зажим трубки.
Закройте крышку прибора и нажмите Go.Растворы липидов и мРНК будут протекать через микрофлюидный картридж, а раствор липидных наночастиц будет собран в конические трубки. Сохраните коническую трубку в конце процесса рецептуры, затем разбавьте липидные наночастицы 5 миллилитрами PBS и шкафом биологической безопасности. Чтобы выполнить буферный обмен, сначала предварительно промыть ультрацентрифужный фильтр размером 100 килодалтонов с 2 миллилитрами PBS, центрифугой, а затем опорожнить PBS из нижнего отсека.
Добавьте разбавленные липидные наночастицы в верхний отсек предварительно промытого ультрацентрифужного фильтра для трех промывок центрифуги, отбрасывая проточную часть и добавляя 5 миллилитров PBS в ультрацентрифужный фильтр после первых двух промывок. После последней промывки пипеткой раствор липидных наночастиц против стенок ультрацентрифуги фильтруют несколько раз, чтобы свести к минимуму потери наночастиц перед переносом раствора наночастиц во флакон без нуклеазы. Затем добавляют PBS, чтобы довести суспензию наночастиц до соответствующей экспериментальной концентрации и объема по мере необходимости.
Для оценки эффективности инкапсуляции липидных наночастиц сначала готовят двукратные последовательные разведения рабочего раствора нуклеиновых кислот в PBS для получения стандартной кривой, начиная с 500 нанограмм на миллилитр и делая не менее пяти разведений. Затем подготовьте разбавление образца наночастиц в PBS для достижения соответствующей теоретической концентрации, которая лежит вокруг средней точки стандартной кривой. Затем готовят рибозеленый РНК-реагент для обнаружения присутствия РНК как внутри, так и снаружи липидной наночастицы путем смешивания соответствующих количеств РНК-реагента, Triton X100 и PBS.
Затем, чтобы обнаружить присутствие РНК вне жидкой наночастицы, смешайте соответствующие количества РНК-реагентов и только PBS. Load реплицирует стандартные растворы нуклеиновых кислот и липидных наночастиц в черную флуоресцентную пластину с 96 скважинами, затем добавляет равный объем реагента количественной оценки РНК с Тритоном X100 и без него к стандарту и образцу реплицируется. Встряхните пластину в считывателе пластин в течение пяти минут при комнатной температуре, защищенной от света, чтобы получить тщательное перемешивание образцов, затем измерьте флуоресценцию на считывателе микропластин при длине волны возбуждения 480 нанометров и длине волны излучения 520 нанометров.
Чтобы измерить гидродинамический размер и полидисперсность липидных наночастиц, сначала разбавляют раствор наночастиц 40 раз в PBS и добавляют раствор в полумикрокювету. Загрузите кювету на Zetasizer и выберите стандартную рабочую процедуру, чтобы настроить прибор для измерения наночастиц в соответствии с их материалом, диспергатором, температурой и типом ячейки. Затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы измерить гидродинамический размер и полидисперсность липидных наночастиц.
Чтобы измерить дзета-потенциал липидных наночастиц, разбавляют раствор наночастиц 40 раз в воде без нуклеаз и загружают раствор в кювету к линии заполнения. Загрузите кювету в анализатор потенциала Зета, позаботившись о том, чтобы электроды контактировали с инструментом, и установите инструмент для измерения Дзета-потенциала в соответствии с конкретным составом липидных наночастиц. Затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы измерить потенциал наночастиц липидов Zeta.
В этом анализе в отдельные дни были разработаны несколько партий липидных наночастиц с одинаковым липидным составом и соотношением амина к фосфату, чтобы продемонстрировать воспроизводимость метода. Как было отмечено, одна и две партии демонстрировали перекрывающиеся распределения размеров с аналогичной полидисперсностью, при этом не наблюдалось существенных различий в размере или эффективности инкапсуляции между партиями. Как правило, изменения в параметрах рецептуры вызывают некоторые небольшие, но статистически значимые различия.
Например, уменьшение соотношения аминов и фосфатов приводит к снижению эффективности инкапсуляции на 4% с сопутствующим увеличением гидродинамического диаметра наночастиц. Липидные наночастицы, составленные с различными ионизируемыми липидами, но одинаковым соотношением аминов к фосфатам, демонстрируют значительное изменение эффективности инкапсуляции, а также небольшие различия в диаметре частиц. Инкапсуляция плазмидной ДНК приводит к более крупным частицам по сравнению с mRA, инкапсулирующим липидные наночастицы, хотя оба типа наночастиц демонстрируют одинаковую эффективность инкапсуляции.
Однако изменения параметра скорости потока не влияют на развитие липидных наночастиц. Липидные наночастицы имеют большое применение, прекрасным примером являются недавно одобренные вакцины против COVID-19. Этот метод служит отличным набором инструментов и прокладывает путь для будущих применений, позволяя проводить скрининг состава нижних конечностей.
