В этом протоколе два антитела от одного и того же хозяина могут быть использованы вместе в иммунофлуоресцентном анализе для изучения взаимодействия клеток хозяина и патогенов. Поскольку существует лишь несколько коммерческих антител, доступных для распознавания специфических клеточных структур и белков у паразитов, этот протокол может быть очень полезным. Это простой в исполнении протокол иммунофлуоресценции двойной маркировки, который использует поликлональные и моноклональные антитела, выращенные у одного и того же вида.
Многие исследователи могут не знать, что это возможно. Такой подход помогает, когда источник антител ограничен. Он может быть использован для обнаружения патогенов в белках клеток-хозяев в инфицированных клетках-хозяевах, а также может быть применен к свободным живым организмам.
Это простой протокол, требующий одного блокирующего шага между первой и второй парой антител. Процедуру продемонстрируют доктор Камила Гаше-Кастро и аспирант Лейс Траяно-Сильва из моей лаборатории. Через три дня после заражения клеток LLC-MK2 Trypanosoma cruzi, соберите супернатант из инфицированных клеток в коническую трубку 15-миллилитровой клеточной культуры.
Центрифугируйте образец, чтобы опустить клеточный мусор, затем поместите трубку при комнатной температуре, чтобы трипомастиготы переплыли к супернатанту. Через 10 минут соберите супернатант в новую коническую трубку, затем центрифугируйте образец и выбросьте супернатант перед повторным использованием гранулы, содержащей паразитов, в полной среде RPMI. Добавьте ячейки LLC-MK2 в 24-луночные пластины, содержащие УФ-стерилизованные округлые крышки, и дайте &m осесть в течение 16 часов.
Затем, чтобы заразить клетки, добавляют в каждую лунку супернатант, содержащий T.Cruzi, и инкубируют в течение шести часов. Затем промыть крышки, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, пять раз PBS, затем зафиксировать клетки 2% параформальдегидом в PBS. Через 10 минут промыть крышки три раза в течение пяти минут каждая с PBS, а затем пропитать крышки неионным моющим средством в течение 10 минут.
После трех пятиминутных промываний PBS инкубируйте крышки в блокирующем растворе в течение 30 минут, а затем еще одну 30-минутную инкубацию с моноклональным или поликлональным антителом мыши. После промывки PBS инкубируют покровы в течение 30 минут с вторичным антителом в блокирующем растворе и фаллоидином для окрашивания актиновых нитей в клетке-хозяине. Затем трижды промойте обшивки PBS, прежде чем наносить небольшое количество анти-выцветающего монтажного реагента со средой DAPI на поверхность слайда.
Используя щипцы, осторожно наклоните крышку в среде, чтобы предотвратить образование пузырьков. Для двойной маркировки, после инкубации покровных пластинок в блокирующем растворе, как показано ранее, инкубируют их в мышином поликлональном антителе в течение 30 минут. Затем промывайте крышки три раза в течение пяти минут каждый PBS, прежде чем инкубировать их с вторичным антителом в течение 30 минут.
Затем, после трех промывок PBS, выполните второй блокирующий этап с помощью антимышечного антимышечного IgG AffiniPure, разбавленного в блокирующем растворе. Через 30 минут снова промойте обтекатели PBS, прежде чем инкубировать их с моноклональным антителом мыши в течение еще 30 минут. Далее, после трех промывок PBS, инкубируйте крышки с козьим антимышьим антителом IgG 2B и фаллоидином.
Затем, после трех промывок PBS, нанесите анти-затухающий монтажный реагент, как показано ранее. Для тройной маркировки, после блокировки покровов и инкубации с мышиным поликлональным антителом, за которым следует козье антимышье антитело, начинают новую инкубацию с кроличьим поликлональным антителом в блокирующем растворе в течение 30 минут. Затем, после трех промывок PBS, инкубируйте покровы с антителами против козьего анти-кролика в течение 30 минут.
Затем, после трех промывок PBS, выполните блокирующий этап с анти-мышиным антителом AffiniPure против мыши, разбавленным в блокирующем растворе в течение 30 минут. Затем снова промыть обшивки перед инкубацией с любым мышиным моноклональным антителом подкласса IgG в течение 30 минут. После трех промывок PBS инкубируйте крышки в течение 30 минут со специфической парой анти-мышиных антител подкласса IgG.
После инкубации промыть крышки три раза в течение пяти минут каждый с PBS. Анализируйте иммунофлуоресцентные образцы с помощью конфокального микроскопа с 63-кратным масляным погружным объективом и обнаруживайте флуоресценцию с помощью фотоумножителя и гибридного детектора. Затем получите все конфокальные изображения с разделенными каналами и выполните обработку изображений с помощью Adobe Photoshop.
Эти изображения конфокальной микроскопии показывают результаты контрольных экспериментов инфицированных и неинфицированных клеток, подчеркивающих специфичность антител в клетке-хозяине и интернализованном паразите. Мышиное поликлональное антитело против Trypanosoma cruzi FAZ распознало гигантский белок T.cruzi в зоне прикрепления жгутика в жгутике паразита, но не в клетке-хозяине. Распределение гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина А1 в ядрах наблюдалось с использованием коммерческого мышиного моноклонального антитела, которое распознает только клетки млекопитающих-хозяев, но не паразита.
Кроме того, ядра хозяина и паразита и паразита кинетопласты были окрашены DAPI, а F-актин хозяина был окрашен фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594, подтверждая специфичность антител. Двойная маркировка иммунофлуоресценции показывает распределение белка в хозяине и паразите, проанализированное с помощью конфокальной микроскопии. Маркировка не предполагала перекрестной реакции между антителами с использованием этой методологии.
Таким образом, протокол, описанный здесь для изучения взаимодействий хозяина и патогена, представляет собой базовую и сложную технику, которая может быть адаптирована к любой комбинации антител. Этот подход делает иммунофлуоресценцию экономически эффективной и может помочь изучить локализацию двух или более белков, представляющих интерес, когда доступно мало антител.
