Этот протокол является простым методом снижения полидисперсности капель с низкой температурой кипения для использования в биомедицинских приложениях. Этот метод конденсирует предварительно сформированные газовые микропузырьки и фильтрует образующиеся капли жидкости по размеру таким образом, чтобы это было контролируемым, масштабируемым и относительно экономически эффективным. Этот метод может быть применен к различным липидным микропузырькам с различной оболочкой и газовым материалом с использованием различных фильтров для контроля конечного размера капель.
Продемонстрировать процедуру будет Дарра Мериллат, исследователь бакалавриата из лаборатории доктора Сирси. Включите выключатель питания для ультразвукового аппарата и установите амплитуду на максимально допустимую с помощью микрозащелки, а также убедитесь, что время обработки ультразвуком установлено равным 10 секундам. Поместите теплый гидратированный липидный раствор в звуковой корпус с микроконфортом прямо под поверхностью.
Прикрепите трубку соответствующей длины к горловине флакона, чтобы направить газ из выходного отверстия резервуара DFB в теплый раствор липидов, удерживаемый в корпусе. Медленно открывайте клапан резервуара, пока не будет видно, как газ течет по раствору липидов, вызывая небольшую рябь на поверхности жидкости. Если поток газа слишком высок, раствор будет переполняться во время образования микропузырьков.
Запустите ультразвуковой аппарат и запускайте его в течение 10 секунд непрерывно, чтобы генерировать микропузырьки. После окончания обработки ультразвуком немедленно закройте клапан резервуара DFB. Быстро закройте микропузырь и погрузите флакон в ледяную ванну, чтобы охладить образец ниже 55 градусов по Цельсию.
Используйте 200-нанометровый керамический фильтр для сборки экструдера высокого давления в соответствии с руководством пользователя и поместите его в центр водонепроницаемого контейнера, чтобы выпускная трубка образца не прижималась к стороне и не обжималась. Подключите экструдер к азотному газовому баллону с помощью адаптера, поставляемого производителем. Поместите конец выходной трубки в сцинтилляционный флакон для сбора экструдированного образца, закрепив трубку на контейнере лентой, чтобы она оставалась внутри флакона.
Откройте и закройте выпускной клапан, чтобы убедиться, что в экструдере нет давления. Снимите крышку камеры. И добавьте пять миллилитров PBS в камеру экструдера.
Замените крышку, убедившись, что она надежно щелкает обратно на место. Откройте резервуар для азотного газа, чтобы манометр показывал 250 фунтов на квадратный дюйм, убедившись, что клапан регулирования давления находится в закрытом положении. Закройте бензобак и откройте впускной клапан камеры экструдера, в результате чего раствор PBS будет проталкиваться через систему, и вывести трубку на выходе образца в сцинтилляционный флакон.
Когда из трубы выходит только газ, откройте выпускной клапан и позвольте давлению упасть до нуля PSI. Затем удалите сцинтилляционный флакон. Откройте и закройте выпускной клапан, чтобы убедиться, что внутри экструдера нет давления, и поместите новый сцинтилляционный флакон на конец выпускной трубки.
Наполните стальной контейнер 2-метилбутаном и добавьте сухой лед, чтобы снизить температуру до минус 18 градусов по Цельсию. Вставьте микропузырьковый раствор в охлажденный 2-метилбутан, погружая образец на две минуты. Переместите флакон в течение двух минут, чтобы аккуратно перемешать пузырьки.
Добавьте сухой лед по мере необходимости, чтобы поддерживать температуру между минус 15 и минус 18 градусами по Цельсию. Через две минуты удалите микропузырьки из охлажденного 2-метилбутана. Аккуратно закрутите флакон, чтобы перемешать микропузырьки, и переложите пузырьки в охлажденный 10-миллилитровый шприц.
Снимите крышку камеры экструдера и добавьте микропузырьковый раствор в камеру, медленно нажимая плунжер на шприц. Замените крышку экструдера, убедившись, что она надежно щелкает на месте. Убедитесь, что клапан регулирования давления и выпускной клапан экструдера находятся в закрытом положении.
Откройте резервуар для азотного газа до тех пор, пока манометр не покажет 250 фунтов на квадратный дюйм. Закройте бензобак и поверните клапан регулирования давления в открытое положение. Когда раствор заполнит сцинтилляционный флакон на выходе из трубки и из трубки выйдет только газ, медленно откройте клапан сброса давления и дайте давлению упасть до нуля PSI.
Переложите 10 миллилитров экструдированного капельного раствора в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте экструдированный образец в 1 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант и самопроизвольно испарившиеся капли, появляющиеся в верхней части раствора.
Повторно суспендировать гранулу, содержащую нанокапли DFP в 10 миллилитрах PBS с 20% глицерина и 20% пропиленгликоля. Распределение по размерам конденсированных пузырьковых растворов с экструзией и без нее показывает, что конденсированный только образец имеет гораздо более широкое распределение, центрированное около 400 нанометров, тогда как экструдированный образец имеет более узкое распределение, центрированное на 200 нанометрах. Перестраиваемый импульсно-чувствительный анализ сопротивления, используемый для анализа капель фазового сдвига, поскольку они были промыты центрифугированием для удаления избыточных липосом, показывает, что размеры капель составляют около 200 нанометров.
Данные микроскопии испарения нанокаплей при нагревании показывают, что некоторые спонтанно испарившиеся микропузырьки проявляются в поле зрения перед нагревом, а после нагрева наблюдается большее количество газовых микропузырьков. Здесь показаны микроскопические изображения нанокапель, вставленных в экструдер непосредственно без предварительного охлаждения, конденсированных при нуле градусов Цельсия и при минус 18 градусах Цельсия. Репрезентативные изображения конденсированных капель октафторпропана до и после испарения также показывают большее количество газовых микропузырьков после нагревания, аналогичных каплям DFB.
Самое главное, что нужно помнить во время этой процедуры, это то, что выход капель сильно зависит от температуры и давления во время конденсации, и небольшие изменения повлияют на результаты. После получения испаряемых капель они могут быть использованы для оптимизации визуализации in vivo и доставки лекарств с использованием ультразвука, а также других приложений in vivo и ex vivo. После разработки этого метода было изучено влияние размера нанокаплета и содержания газового ядра на пороги испарения in vivo с использованием небольших модификаций этого протокола.
