Имплантация клеток остеосаркомы внутри микроокружения большеберцовой кости способствует метастазированию в легкие. Эта модель также может быть полезна для изучения механизмов легочного метастазирования или новых методов лечения рака, которые требуют неповрежденной иммунной системы. После того, как опухоль была установлена, ампутация необходима для контроля скорости метастазирования в долгосрочных исследованиях выживаемости.
Мы используем яремные инъекции, чтобы обеспечить визуализацию внутривенной доставки лекарств. Инъекция в яремную вену полезна для многих других моделей заболеваний, для которых требуется точная доставка лекарств. Мы использовали этот метод для доставки наночастиц и радиоактивных лиганов для визуализации in vivo.
Мы советуем новым пользователям попрактиковаться в удалении конечности от пяти до 10 усыпленных крыс, прежде чем пытаться провести эксперимент по освоению механики ампутации конечностей без потери крови. После подтверждения отсутствия реакции на рефлекс полового члена закрепите анестезируемую крысу в носовом конусе на тепловизионной грелке в положении лежа на спине. Удалить волосы на правой ноге, вплоть до вентральной и спинной нижней части живота.
Используйте марлю или спрей для дезинфекции хирургической области 70% этанолом и соответствующим разбавленным антисептиком и нанесите мазь на глаза животного. Используя сверлообразное движение, чтобы сделать отверстие, вставьте иглу 22-го калибра, отмеченную в 10 миллиметрах от кончика 10 миллиметров, в диафиз большеберцовой кости в середине большеберцового плато, протягивая иглу через метафиз в диафиз. После удаления иглы осторожно смешайте интересующую суспензию опухолевой клетки, чтобы получить однородную клеточную суспензию, и загрузите 7,5 х 10 до четвертой части клеток в 20 микролитрах PBS в шприц Гамильтона.
Отметьте шприц Гамильтона ячейками в 10 миллиметрах от кончика иглы и вставьте иглу до 10-миллиметровой отметки в отверстие, сделанное иглой 22-го калибра. Затем аккуратно выгрузите весь объем клеток в полость костного мозга, и поместите крысу в клетку на грелку с контролем до полного покоя. Для внутривенного введения доксорубицина после подтверждения анестезии используйте тщательное рассечение для визуализации правой или левой яремной вены и вставьте иглу в вышележащую мышечную ткань.
Направьте иглу к головке в просвет яремной вены, так как она визуализируется в яремной вене перед грудной мышцей, и втяните небольшой объем крови в кончик иглы, чтобы подтвердить точное введение. Когда игла на месте, медленно вводите от 100 до 150 микролитров двух миллиграммов на килограмм доксорубицина в течение одной минуты. Раствор должен быть виден внутри вены во время родов.
Когда весь раствор будет доставлен, используйте стерильную марлю, чтобы оказать мягкое давление на вену, и используйте три-четыре раневых зажима, чтобы закрыть разрез. После подтверждения седации удалите волосы на правой ноге, вплоть до вентральной и спинной нижней части живота, и поместите крысу в лежачее положение на грелке. Очистите кожу от середины икры до чуть выше тазобедренного сустава правой нижней части живота, как показано на рисунке, и нанесите мазь на глаза животного.
Используя стерильные перчатки и инструменты, протяните ногу через вентиляционное отверстие стерильной хирургической драпировки и сделайте окружной кожный разрез прямо проксимально к удушью. Деглавировать заднюю конечность, чтобы обнажить бедренную артерию и вену на вентрально-медиальной поверхности задней конечности, и использовать 4-0 рассасывающихся швов для оспаривания сосудов на уровне средней бедренной кости и трансекции дистально. Зажмите вену дистально, чтобы уменьшить утечку во время рассечения мышц и используйте тупое рассечение для абдукции тазобедренного сустава боковым вращением наружу.
Найдите и расчлените головку бедренной кости от вертлужной впадины и удалите любую оставшуюся ткань, сохраняя ногу прикрепленной к телу. Введите блок брызг в вертлужную впадину и седалищный нерв примерно шестью миллиграммами на килограмм ропивакаина и используйте простой прерванный рассасывающийся шов 4-0, чтобы закрыть мускулатуру над вертлужной впадиной. Затем используйте раневые зажимы, помещенные от пяти до 10 миллиметров, чтобы закрыть края кожи.
Рентгеновская визуализация для наблюдения за опухолью позволяет подтвердить инвазию костной опухоли и может быть выполнена на недавно ампутированных или закрепленных формалином конечностях. Рентгеновская визуализация также позволяет оценить рентгенографическую морфологию легких с метастазами и без них, обеспечивая быстрый и простой метод определения необходимости эвтаназии для предотвращения ненужных спонтанных смертей. При остеосаркоме крыс морфология как остеолитической, так и остеобластной опухоли может быть подтверждена гистопатологией ампутированной конечности.
Обратите внимание, что кортикальная кость отсутствует в этом примере и что соседняя кость была заменена или укреплена новой тканой костью, которая ориентирована перпендикулярно существующему стволу коры. Островки незрелых остеоидов также могут быть идентифицированы внутри опухоли. На этих снимках может наблюдаться микроскопическая морфология репрезентативных метастазов в легкие, некоторые с минерализованными костовидными и опухолевыми сосудистыми эмболами.
Иммуноокрашивание опухолей первичной остеосаркомы может выявить инфильтрацию опухолей популяциями иммунных клеток, такими как CD68-положительные макрофаги или CD3-положительные Т-клетки. Западное блоттинг лизатов белка опухолевых клеток может быть использовано для определения экспрессии протеинкиназ, рецепторов протеинкиназы и других белков, которые взаимодействуют с этими путями. Для имплантации большеберцовой кости, как только будет сделано первое отверстие большеберцовой кости, продолжайте держать ногу в недоминирующей руке под тем же углом, чтобы сохранить кожу и костные отверстия выровненными, чтобы облегчить введение иглы Гамильтона.
Для яремной инъекции вставьте иглу в мышцу, но не наклоняйте иглу слишком сильно, чтобы избежать пропуска вены. Для ампутации сначала практикуйте дисартикуляцию на усыпленных крысах.
