Этот протокол обеспечивает настольный метод оценки эффективности и механизмов действия гистотрипсии с помощью тромболитической терапии или лизотрипсии, альтернативного неинвазивного подхода для лечения критического тромбоза глубоких вен. Этот метод использует активность пузырьков для двустороннего эффекта через повышенный фибринолиз из-за усиленной доставки литики и гемолиза красных кровяных клеток в сгустке. Этот настольный подход к лечению тромбоза глубоких вен облегчает моделирование тромбов, лечение лизотрипсией и одновременную визуализацию во время лечения.
Генерация пузырьковых облаков, планирование лечения и руководство по изображениям могут быть дополнительно использованы для исследования методов лечения других заболеваний, таких как опухоли почек и печени, на основе гистотрипсии in vitro. Чтобы настроить источник гистотрипсии, установите источник на моторизованную систему позиционирования. Накройте массив визуализации крышкой зонда и зафиксируйте массив коаксиально в отверстии источника гистотрипсии.
Подключите массив изображений к системе ультразвукового сканирования и полностью погружайте источник гистотрипсии и массив визуализации в резервуар. Используйте шприц, чтобы аккуратно удалить пузырьки воздуха, и используйте массив изображений и сканер для получения дегазированных изображений воды в режиме B со скоростью 20 кадров в секунду. При получении изображений отрегулируйте положение массива изображений внутри отверстия конфокального преобразователя до тех пор, пока пузырьковое облако не будет расположено примерно в центре окна изображения, и запишите обнаруженное фокальное местоположение в окне изображения.
Затем прекратите инсонацию и установите напряжение, приложенное к источнику гистотрипсии, равным нулю. Чтобы подготовить сгусток к анализу, используйте плоскогубцы, чтобы разрезать герметичный конец пипетки, содержащей сгусток, и дайте сгустку и сыворотке скользить в чашку Петри. Используйте скальпель, чтобы разрезать сгусток до одного сантиметра длины и используйте чистящую салфетку, чтобы аккуратно промокнуть разрезанный участок, чтобы удалить лишнюю жидкость.
Используйте пинцет, чтобы аккуратно поместить участок сгустка на весы и записать вес. Затем вручную поднимите канал потока из дегазированного резервуара для воды обратного осмоса и извлеките модель сосуда из канала. Используйте пинцет, чтобы аккуратно поместить сгусток в модельный сосуд, не повреждая сгусток, и прикрепить сосуд к каналу потока.
Опустите канал потока в резервуар таким образом, чтобы проксимальный конец ступени относительно резервуара был низким по сравнению с дистальной стороной, и используйте пипетку, чтобы добавить 30 микролитров нагретой плазмы 37 градусов Цельсия в резервуар. Контролируйте температуру резервуара для воды, пока она не достигнет по крайней мере 36 градусов по Цельсию, и используйте пипетку, чтобы добавить 80,4 микрограмма rt-PA в плазменный резервуар. Чтобы загрунтовать канал потока, используйте шприцевой насос для вытягивания плазмы из резервуара в канал до тех пор, пока модельный сосуд не будет заполнен.
Затем вручную выровняйте модель судна, чтобы убедиться, что в сосуде модели нет пузырьков воздуха, как видно в окне визуализации. Чтобы спланировать путь для источника гистотрипсии и массива изображений для равномерного воздействия гистотрипсии по длине сгустка, используйте сценарий визуализации, чтобы использовать моторизованные позиционеры для выравнивания массива изображений параллельно длине сгустка и подтверждения того, что в сосуде нет пузырьков воздуха. Используйте моторизованные позиционеры для выравнивания массива изображений таким образом, чтобы плоскость изображения была параллельна поперечному сечению сгустка.
Используя окно визуализации в качестве ориентира, переместите источник гистотрипсии к проксимальному концу сгустка, относительно резервуара. Чтобы определить путь инсонации по длине сгустка, задайте путевые точки по длине сгустка с шагом в пять миллиметров. Перед завершением каждой путевой точки огневые тестовые импульсы от источника гистотрипсии с теми же параметрами инсонации, которые были продемонстрированы, но с общим воздействием, уменьшенным до 10 суммарных импульсов.
В каждой путевой точке сохраняйте положения двигателя с помощью команд, назначенных производителем. Чтобы обработать сгусток по его длине в соответствии с путем, определенным на этапе предварительной обработки, установите шприцевой насос на 0,65 миллилитра в минуту и дождитесь движения мениска плазмы. Интерполировать путь обработки промежуточными шагами между установленными путевыми точками с фиксированным размером шага и использовать позиционеры для перемещения источника гистотрипсии в каждом месте контура, используя первоначально заданные параметры инсонации.
Далее создайте скрипт для настройки массива визуализации на получение B-режима изображения сгустка и модельного сосуда за несколько секунд до применения импульса гистотрипсии в каждом месте. Затем применяйте импульс гистотрипсии в каждой путевой точке, приобретая акустические излучения в скрипте для формирования пассивных кавитационных изображений после анализа. Используйте окно визуализации для изображения активности пузырьков во время применения импульса гистотрипсии в каждом месте пути.
После анализа вручную поднимите сосуд модели из резервуара для воды, чтобы слить перфусат под действием силы тяжести, и используйте шприцевой насос для вытягивания плазменного раствора из протокового канала, чтобы обеспечить сбор всего перфузата в небольшой контейнер. Отсоедините модельный сосуд и удалите сгусток. Затем протрите сгусток лабораторными тканями и взвесьте сгусток, чтобы оценить потерю массы сгустка.
При подаче достаточного напряжения на источник гистотрипсии в фокальной области преобразователя генерируется пузырьковое облако и визуализируется с помощью ультразвуковой визуализации. Фокальная позиция определяется как центр пузырькового облака. Этот контрольный перфузат сгустка, подвергаемого воздействию только плазмы, и этот перфусат сгустка, обработанного лизотрипсией, использовались для оценки содержания гемоглобина и D-димера, как показано.
Изменчивость концентрации гемоглобина может быть количественно определена оптическим поглощением. Здесь сгусток может быть визуализирован в модельном сосуде с помощью визуализации в B-режиме до экспозиции гистотрипсии для определения положения сгустка для сегментации пассивного кавитационного изображения. Как подтверждает это пассивное кавитационное изображение, совместно зарегистрированное с изображением сгустка в B-режиме, акустическая энергия содержится в основном внутри сгустка во время экспозиции гистотрипсии.
В образцах, подвергшихся гистотрипсии, разрушение в основном ограничивается центром сгустка, что согласуется с наблюдаемыми местами активности пузырьков, отслеживаемыми с помощью пассивной кавитационной визуализации. С добавлением литика потеря массы происходит и в областях, близких к периферии сгустка. Альтернативно, экогенные липосомы, содержащие rt-PA, могут быть использованы вместо системной доставки RT-PA, чтобы позволить оценить целевую доставку лекарственного средства в сгусток.
Лизотрипси обеспечивает альтернативный неинвазивный подход к лечению многих заболеваний. Этот протокол in vitro позволяет оценить эффективность лечения и его потенциальный успех при применении in vivo.
