Предложен способ регулирования активности полимеразы с использованием искусственных факторов транскрипции нуклеиновых кислот. Эта генная регуляторная архитектура может служить строительным блоком для будущих генетических устройств in vitro. Привязывая днк-связывающий домен к РНК-полимеразе Т7, этот метод сочетает в себе масштабируемость схем на основе ДНК с функциональностью транскрипционных цепей.
Начните с внесения девяти разведений одноцепочечного олигонуклеотида BG в конечный объем 50 микролитров двойной дистиллированной воды, от пяти до одного к одному-пяти соотношениям, как указано в таблице. Готовят по одной реакционной смеси для каждого разбавления, смешивая два микролитра буфера SNAP с четырьмя микролитрами олигонуклеотида BG и четырьмя микролитрами SNAP T7 RNAP. Подготовьте контроль RNAP, заменив олигонуклеотид двойной дистиллированной водой, и контроль ДНК, заменив SNAP T7 RNAP двойной дистиллированной водой.
Настройте 11 реакций, добавив два микролитра каждого образца к четырем микролитрам буфера SNAP и два микролитра красителя с загрузкой белка на образец. Нагрейте реакции в течение 10 минут при 70 градусах Цельсия, прежде чем загрузить два микролитра каждого образца на протеиновый гель от четырех до 12% стекловидного тела в течение 35 минут гелевого электрофореза на льду при 200 вольтах. В конце прогона промыть гель тремя водообменами на шейкере не менее 10 минут за одну стирку с последующим окрашиванием нуклеиновой кислотой цианиновым красителем в течение 15 минут.
Нанесите изображение геля на соответствующую систему визуализации геля и снова окрасьте гель 20 миллилитрами синего coomassie. Через один час очистите от пятна двойной дистиллированной водой в течение по крайней мере одного часа, прежде чем снова визуализировать гель. Для олигонуклеотидной очистки SNAP T7, во-первых, приготовьте буфер элюирования, смешивая 50 микролитров одного молярного следа, со 100 микролитрами пяти моляров хлорида натрия, с 850 микролитрами двойной дистиллированной воды.
Затем поместите одну ионообменную колонну на образец в отдельные две миллилитровые центрифужные трубки и промывайте колонны с буфером очистки центрифугированием до тех пор, пока весь буфер не будет элюирован из каждой колонны. Разбавьте каждый образец буфером очистки при соотношении три к одному буферу очистки к образцу и загрузите 400 микролитров образца в каждую колонку. Когда весь буфер будет элюирован, как показано, соберите и пометьте поток для каждого образца.
Промывайте колонны три раза 400 микролитрами буфера очистки на одну промывку до тех пор, пока весь буфер не будет элюирован за одну промывку, собирая и маркируя поток по мере необходимости. После последней промывки соберите элюированный белок, добавив 50 микролитров буфера элюирования в центр колонны и центрифугируя колонку три раза, пока все 50 микролитров буфера не будут элюированы. Соберите и пометьте элют после каждой центрифугирования, объединяя элют в одну трубку после последней центрифугирования, оставляя небольшой объем каждого элюта для анализа геля.
Измерьте поглощение оставшихся элюдных аликвот на 260 и 280 нанометрах и добавьте глицерин в образцы в соотношении один к одному для хранения минус 20 градусов до их использования. Используйте 500 микролитровый центрификатор 30 килодалтон для буферного обмена общего элюированного продукта с 2-кратным буфером хранения. И измерьте поглощение, как показано.
Затем добавьте глицерин в продукт в соотношении один к одному для хранения при температуре минус 20 градусов цельсия. Чтобы оценить элюирование с помощью SDS-PAGE, запустите образцы в соответствующей белковой лестнице на четырех-12% стекловидном геле в течение 35 минут при 200 вольтах или до тех пор, пока передняя часть красителя не мигрирует к концу геля. Чтобы продемонстрировать контрольную активность привязанного RNAP по требованию, смешайте 2,4 микролитра каждого шаблона с пятью микролитрами 5-кратного буфера отжига и 14,2 микролитрами двойной дистиллированной воды.
Инкубируйте полученный один микромолярный двухцепочечный ДНК CAGE при 75 градусах Цельсия в течение двух минут. И отжигьте смысловые и античувственные штаммы ДНК промотора и малахитового зеленого аптамера таким же образом, как указано в таблице. В конце инкубации добавьте привязанный SNAP T7 RNAP к двухцепочечной КЛЕТКЕ ДНК в соотношении от одного до пяти моляров к конечной концентрации 500 наномолярных РНКП.
Через 15 минут при комнатной температуре поместите образец на лед и смешайте 2,5 микролитра 10x буфера транскрипции in vitro с одним микролитром 25 миллимолярного рибонуклеозидтрифосфата, одним микролитром одного миллимолярного малахитового зеленого цвета, 2,5 микролитрами смеси RNAP CAGE, 2,5 микролитрами каждого из одних микромолярных факторов транскрипции A и B олигонуклеотидов, и три микролитра одного миллимолярного малахитового зеленого аптамера в 10 микролитрах двойной дистиллированной воды. В 15 микролитрах двойной дистиллированной воды создали вторую реакцию, содержащую 2,5 микролитра 10x буфера транскрипции in vitro, один микролитр 25-миллимолярной рибонуклеозидтрифосфатной смеси, один микролитр одного миллимолярного малахитового зеленого цвета, 2,5 микролитра смеси RNAP CAGE и три микролитра одного шаблона миллимолярного малахитового зеленого аптамера. Чтобы создать реакцию, содержащую только буфер, смешайте 2,5 микролитра 10x буфера транскрипции in vitro, один микролитр 25-миллимолярной рибонуклеозидтрифосфатной смеси, один микролитр одного миллимолярного малахитового зеленого и три микролитра одного миллимолярного малахитового зеленого аптамера в 17,5 микролитрах двойной дистиллированной воды.
Когда все реакции будут подготовлены, перенесите каждую реакцию на 384-луночную пластину и контролируйте транскрипцию малахитового зеленого аптамера на считывателе флуоресцентных пластин в течение двух часов при 37 градусах Цельсия при возбуждении 610 нанометров и излучении 655 нанометров. В конце показаний поместите пластину на лед и запустите РНК-продукт из каждой лунки в денатурирующем 12%-TBE-мочевинном полиакриловом геле в буфере TBE 70 градусов Цельсия при 280 вольтах в течение 20 минут или до тех пор, пока передняя часть красителя не достигнет конца геля. Затем окрасьте гель окрашиванием нуклеиновой кислоты цианинового красителя в течение 10 минут на орбитальном шейкере, перед визуализацией, как показано.
Успешная экспрессия и очистка рекомбинантного белка SNAP T7 RNAP может быть подтверждена с помощью SDS-PAGE. Следуя SDS-PAGE, ферментативная активность может быть подтверждена реакцией транскрипции in vitro. Успешное соединение функционализированных олигонуклеотидов BG может быть проверено с помощью 18% денатурирующего TBE-мочевины PAGE.
По сравнению с немодифицированным олигонуклеотидом, добавление фрагмента BG к олигонуклеотиду увеличивает его молекулярную массу. Как наблюдалось в этом репрезентативном геле для окрашивания цианинового красителя для подтверждения днк-привязанной очистки T7 RNAP от избыточных олигонуклеотидов BG, начальный поток через фракцию содержал в основном избыток Олигонуклеотида BG, а также небольшую часть ДНК-привязанной полимеразы, которая не связывалась с катионообменной смолой. Фракции разбавления пула содержали только одну полосу олиго RNAP, вызванную связыванием цианинового красителя с олигонуклеотидным тросом, причем полоса повышенной концентрации продукта демонстрировала ту же, но более темную полосу, означающую успешную повышенную концентрацию.
Те же закономерности наблюдаются при синем окрашивании Кумасси, с небольшим сдвигом подвижности геля, наблюдаемым в контроле неконъюгированной РНКП. Здесь показан флуоресцентный сигнал, производимый в конце транскрипции in vitro в кинетике реального времени. В этом анализе наблюдалась 336-кратная активация флуоресцентного сигнала, демонстрирующая надежный контроль активности полимеразы.
При попытке этого протокола не забудьте тщательно смыть SDS с геля перед окрашиванием нуклеиновыми кислотами. Это связано с тем, что STS будет задерживать краситель в геле, что приводит к высокому фоновому сигналу. Применение нашего метода к большой генной цепи с несколькими каскадами покажет масштабируемость и компонуемость привязанной системы транскрипции.
Этот метод в настоящее время используется для разработки генных схем, способных к вычислениям в стиле нейронной сети.
