Этот протокол позволяет манипулировать белками или экспрессией микроРНК в дифференцированных адипоцитах для изучения их роли в функции адипоцитов. Этот метод обратной трансфекции является простым, экономичным и высокоэффективным методом трансфекции олигонуклеотидов в адипоциты мыши 3T3-L1. Этот метод также может быть применен к преадипоцитам человека, дифференцированным в адипоциты.
Продемонстрировать процедуру будет Мелани Гаудфрин, техник из нашей лаборатории. Выращивайте фибробласты 3T3-L1 в 100-миллиметровых блюдах в DMEM без пирувата, 25 миллимолярной глюкозы, 10% сыворотки новорожденных телят и одного процента пенициллина и стрептомицина. Поместите посуду в инкубатор культуры тканей при 37 градусах Цельсия и семи процентах углекислого газа.
Через два дня после слияния измените культуральный среду, заменив ее ДМЭМ без пирувата, 25 миллимоляров глюкозы, 10% FCS и один процент пенициллина и стрептомицина, дополненных 0,25 миллимоларом IBMX, 0,25 микромоляром дексаметазоном, пятью микрограммами на миллилитр инсулина и 10 микромолярами росиглитазоном. Насиживать блюда в течение двух дней. Через два дня замените культуральный среду ДМЭМ без пирувата, 25 миллимоляров глюкозы, 10% FCS и одного процента пенициллина и стрептомицина, дополненных пятью микрограммами на миллилитр инсулина и 10 микромолярной росиглитазоном и инкубировать еще два дня.
Кормите клетки каждые два дня DMEM без пирувата, 25 миллимолярной глюкозой, 10% FCS и одним процентом пенициллина и стрептомицина и держите клетки в инкубаторе. За сутки или несколько часов до трансфекции готовят раствор коллагена I типа по 100 мкг на миллилитр в 30%-ном этаноле из запасного раствора по одному миллиграмму на миллилитр. Добавьте 250 микролитров коллагена на лунку 12-луночной пластины или 125 микролитров на лунку 24-луночной пластины и распределите раствор по поверхности скважины.
Оставьте тарелку без крышки под культуральным капюшоном до тех пор, пока коллаген не высохнет. Затем дважды вымойте его D-PBS. Пипетку siRNA с улучшенной минимально необходимой средой для смешивания и инкубации в течение пяти минут при комнатной температуре.
Добавьте трансфекционный реагент и улучшенную минимальную необходимую среду к siRNA и пипетке для смешивания. Инкубировать его в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавьте трансфекционную смесь в каждый кладезы коллагеновой пластины.
Дважды вымойте ячейки в 100-миллиметровой чашке Петри с помощью D-PBS. Добавьте 5x трипсина в клетки, обязательно покрывая всю поверхность трипсином. Подождите 30 секунд и аккуратно удалите трипсин.
Высиживая чашку Петри в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия в инкубаторе. Затем постучите по чашке, чтобы отсоедать клетки, избегая повреждения клеток. Добавьте 10 миллилитров DMEM без пирувата, 25 миллимоляров глюкозы, 10% FCS и один процент пенициллина и стрептомицина для нейтрализации трипсина.
Осторожно пипеткой на среду вверх и вниз, чтобы отсоедать клетки и гомогенизировать клеточную суспензию. Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Malassez или автоматизированного счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 0,625 миллиона клеток на миллилитр среды. Засеять 800 микролитров клеточной суспензии на лунку 12-луночной пластины или 400 микролитр клеточной суспензии на лунку 24-луночной пластины, содержащей трансфекционную смесь.
Высиживайте пластинки в инкубаторе клеточной культуры и не тревожите их в течение 24 часов. На следующий день осторожно замените супернатант свежим DMEM без пирувата, 25 миллимолярной глюкозой, 10% FCS и одним процентом пенициллина и стрептомицина и верните клетки в инкубатор. Типичные временные точки для обнаружения нокдауна цели после доставки siRNA или miR составляют от 24 до 48 часов для мРНК и от 48 до 96 часов для белка.
Функциональные эксперименты могут быть выполнены на трансфефедированных адипоцитах, включая передачу сигналов инсулина, поглощение глюкозы, секрецию адипокина, липолиз и липогенез. Было показано, что адипоциты сохраняют свою морфологию после трансфекции. Через два дня после трансфекции адипоциты представляли многолокулярные липидные капли с содержанием липидов, не отличающихся между трансфектными и неперефраженными адипоцитами.
Экспрессия мРНК различных маркеров дифференцировки была неизменной в трансферазированных клетках по сравнению с экспрессией в неперепраженных адипоцитах. Протокол обратной трансфекции эффективен, так как более 70% адипоцитов были трансфектражировались. Через три дня после трансфекции siRNA против Перилипина-1 уровень мРНК Перилипина-1 снизился на 70%, а уровень белка на 63%, экспрессия Перилипина-1 также была проанализирована флуоресцентной микроскопией через четыре дня после трансфекции и было обнаружено, что она снизилась на 92% по сравнению с ее экспрессией в контрольных адипоцитах.
Здесь показана обратная трансфекция адипоцитов микроРНК, имитирующих олигонуклеотиды, для повыполнения экспрессии miR-34a. Чрезмерная экспрессия miR-34a привела к снижению экспрессии белка VAMP2 на 50% Нокдаун Перилипина-1 в адипоцитах 3T3-L1 привел к увеличению базального липолиза, в то время как чрезмерная экспрессия miR-34a привела к ингибированию инсулин-индуцированного фосфорилирования протеинкиназы B и поглощения глюкозы. Важно достичь высокого уровня дифференцировки адипоцитов для выполнения трансфекции на вновь дифференцированных адипоцитах и тщательно контролировать лечение адипоцитов трипсином.
После трансфекции можно проводить функциональные эксперименты на адипоцитах для изучения влияния белков или манипуляций с микроРНК на передачу сигналов инсулина, поглощение глюкозы, липогенез и липолиз.
