Этот протокол обеспечивает экспериментальные настройки для выполнения контролируемых 2D и 3D кокультур в микроустройствах для визуализации и мониторинга перекрестных помех между опухолью и иммунными клетками и анализа эффектов противораковых методов лечения. Эта технология обеспечивает простую визуализацию рекрутирования и взаимодействия иммунных клеток в режиме реального времени и может быть использована для образцов, полученных от человека и пациента. Он совместим с большинством современных микроскопов.
Продемонстрируют процедуру Франческо Ното, аспирант кафедры онкологии и молекулярной медицины Istituto Superiore di Sanita, а также Николета Мандука и Эстер Маккафео, аспиранты Католического университета дель Сакро Куоре, кафедра трансляционной медицины и хирургии. Стружка предварительно активируется плазмой в плазменном очистителе или реактивной машине для травления железа в чистом помещении. Клетки мышиной селезенки и линия опухолевых клеток используются здесь для имитации протоколов, описанных в тексте.
Перед загрузкой суспензий ячеек извлеките среды из всех шести резервуаров. Затем медленно загружают 1 х 10 к 5-м опухолевым клеткам, ресуспендированным в 10-50 микролитрах питательной среды в верхнем левом резервуаре и нижней лунке. С правой стороны аккуратно пипеткой 1 x 10 к 6-м плавающим иммунным клеткам, ресуспендированным в 50 микролитрах питательной среды, в две лунки.
Когда все клетки будут добавлены, заполните все шесть резервуаров каждого чипа до 100-150 микролитров питательной среды и убедитесь, что клетки были правильно распределены в каждом культуральном отсеке. Инкубируйте чип в течение одного часа, чтобы система стабилизировалась перед покадровой записью. Для визуализации живых клеток установите иммунную опухоль на пластину чипа на столике микроскопа.
Настройте параметры рабочего процесса сбора данных в программном интерфейсе микроскопа, например в программном обеспечении для анализа живых клеток Incucyte. Подбирайте окна наблюдения, оптимальную частоту кадров и продолжительность времени в зависимости от подходящих параметров для эксперимента и типов исследуемых клеток. Изображение ячеек за соответствующий экспериментальный период времени.
Приготовьте две аликвоты матригеля, разбавленные средой, содержащей лекарственное средство, или комбинацию лекарств для двух экспериментальных условий, используя холодные наконечники. Аккуратно пипеткой нанесите живые, флуоресцентные окрашенные красителем опухолевые клетки, взвешенные в матричном растворе на льду, чтобы получить однородное распределение клеток. С чип-пластиной на охлаждающем блоке или на корзине со льдом медленно вводите обработанный препаратом раствор матрикса опухолевых клеток в левый и правый порты геля с помощью холодных наконечников микропипеток объемом 10 микролитров.
Слегка надавите, чтобы протолкнуть матричный раствор с одной стороны канала на другую. Когда все опухолевые клетки будут загружены, поместите устройство в инкубатор в вертикальном положении на 30 минут. В конце инкубации, после завершения матричного гелеобразования, заполните каналы среды всех шести резервуаров 50 микролитрами питательной среды.
Проверьте целостность полимеризованного геля и распределение опухолевых клеток под микроскопом. Затем поместите чипсы в инкубатор до завершения подготовки иммунных клеток. После инкубации аспирируйте среду из каждой лунки.
Поместите наконечник рядом с входным отверстием среднего среднего канала и под умеренным давлением осторожно введите 10 микролитров 10 в 6-ю иммунную клетку, помеченную контрастным флуоресцентным красителем. Введите от 50 до 100 микролитров среды в каждую из четырех лунок боковых каналов, от 40 до 90 микролитров среды в верхнюю центральную лунку и от 50 до 100 микролитров среды в нижнюю центральную лунку. Когда все лунки будут загружены, используйте микроскоп, чтобы убедиться, что распределение иммунных клеток остается ограниченным центральной камерой.
Затем аккуратно поместите устройство на ровную поверхность в инкубаторе клеточных культур до получения изображения. Чтобы рассчитать степень проникновения флуоресцентно окрашенных живых иммунных клеток в опухолевые компартменты, снимите устройство в определенные моменты времени с помощью флуоресцентной микроскопии и установите соответствующие параметры камеры в программном обеспечении для обработки изображений микроскопа, таком как Nikon NIS-Elements. Также задайте параметры для меченых иммунных клеток.
Движение лейкоцитов через соответствующим образом построенные микроканальные мостики в микрофлюидной платформе к их клеткам-мишеням можно отслеживать с помощью видеомикроскопии. В этом анализе отслеживания отдельные PBMC были озадачены умирающими раковыми клетками, обработанными доксорубицином, или живыми раковыми клетками, обработанными PBS. Соответствующие значения хемотаксиса и графики миграции были сгенерированы автоматически, и другой миграционный профиль для иммунных клеток наблюдался при совместной загрузке с клетками рака молочной железы, подвергшимися воздействию доксорубицина или PBS.
Когда PBMC сталкивались с апоптотическими раковыми клетками, они пересекали микроканалы к умирающим и мертвым клеткам, но не переходили к живым, необработанным клеткам. Часть лейкоцитов с увеличением плотности в течение 24-48 часов демонстрировала длительные контакты с раковыми клетками, обработанными доксо. В этом анализе новая 3D-иммунокомпетентная модель опухоли была использована для количественной оценки рекрутирования иммунных клеток в ответ на противораковые комбинации эпигенетических препаратов.
Затем PBMC, помеченные красным красителем, были равномерно распределены в центральную жидкостную камеру. Затем сравнивали способность двух опухолевых масс притягивать PBMC, при этом PBMC были надежно рекрутированы в этом эксперименте в правый микроканал. Для 3D-модели смешайте раствор с гидрогелем и клетками на льду, избегая пузырьков и предварительной полимеризации.
Вводите его медленно, без чрезмерного давления. Настройте этапы полимеризации в соответствии с используемой матрицей. Могут быть реализованы анализы живых/мертвых клеток и профилирование секреции цитокинов из супернатантов.
Иммунофлюоресценция для конфокальной визуализации может быть выполнена для классификации иммунных подтипов и для маркеров экспрессии созревания активации и истощения.
