Этот протокол позволяет пользователям изучать, как иммунная система производит антитела к патогенным микроорганизмам или commensal микробов. Кроме того, молекулярные пути, которые регулируют диверсификацию генов иммуноглобулина, могут быть изучены с помощью генетически модифицированных мышей. Протокол использует сочетание общих методов молекулярной биологии, включая секвенирование ПЦР и Сэнгера, и не требует сортировки одной клетки или глубокого секвенирования.
Патчи Пейера можно легко спутать с окружающей жировой тканью. Таким образом, визуальная демонстрация этого метода может быть полезна для тех, кто не знаком с этим органом, чтобы определить его местоположение и наблюдать его вскрытие. Начните с укладки мыши на вскрытии площадку с животом подвергаются.
Обильно распылить тело мыши с 70%этанола до принятия каких-либо разрезов для стерилизации области вскрытия. Сделайте разрез на коже живота и потяните одновременно по обе стороны разреза пальцами или мипсами. Затем вырезать брюшной полости ножницами, чтобы разоблачить внутренние органы.
Найдите тонкой кишки и удалить его, разрезая ниже желудка и выше cecum. Удалите любые соединительной ткани и жира, связывающие складки тонкой кишки вместе. Изучите внешнюю поверхность тонкой кишки для патчей Пейера, которые представляют если выглядеть небольшими овальной формой структур, которые кажутся белыми ниже тонкого слоя полупрозрачных эпителиальных клеток.
Тщательно акциз все видимые патчи Пейера с ножницами и собирать их в 1,5 миллилитров микро центрифуги трубки, содержащей один миллилитр буфера FACS на льду. Если собранная ткань опускается на дно трубки, это на самом деле патч Пейера, а не жировой ткани. Поместите 40 микрометровый фильтр в шесть хорошо блюдо с одним миллилитров холодного буфера FACS, а затем залить патчи Пейера из 1,5 миллилитров трубки на фильтр.
Используйте плоский конец поршеня из одного миллилитрового шприца в качестве пестика, чтобы раздавить патчи Пейера на фильтре, пока не останется только соединительная ткань. Вымойте фильтр и поршень с одним миллилитр холодного буфера FACS, чтобы освободить клетки в шесть хорошо блюдо. Соберите клетки и фильтровать их через 40 микрометровый ситечко крышка FACS трубки.
Затем вымойте крышку ситечком одним миллилитром холодного буфера FACS. Пеллет клетки центрифугирования их при 600G при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем высасывь супернатант и повторно помесить клетки в 0,4 миллилитров холодного буфера FACS с блоком FC.
Инкубировать образцы на льду в течение 15 минут, затем мыть и гранулы клеток. Чтобы испачкать герминал центр В-клеток или ГХК, повторно помеспендовать клетки дикого типа в 80 микролитров буфера FACS. Удалите 10 микролитров клеток из патчей дикого типа Пейера для каждого контроля окрашивания.
Оставляя 40 микролитров клеточной подвески для экспериментальных образцов. Кроме того, используйте компенсационные бусинки для контроля окрашивания. Пятно каждого из экспериментальных образцов в 500 микролитров холодного буфера FACS с 2,5 микролитров PNA Biotin в течение 15 минут на льду.
Затем мыть PNA пятна клеток. Пятно каждого образца с 500 микролитров коктейля GCBC в темноте и на льду в течение 15 минут, убедившись, что клетки полностью повторно в коктейль. Чтобы подготовить одиночные элементы управления пятнами для матрицы компенсации, окрашивайте клетки в 500 микролитров холодного буфера FACS с помощью разбавления, указанного в тексте.
Инкубировать окрашивание элементов управления в темноте на льду в течение 15 минут. Добавьте два миллилитров холодного буфера FACS, чтобы вымыть все образцы пятен и элементы управления. Пеллет клетки и отказаться от супернатанта до повторного перерасхода клеток в окончательном объеме 500 микролитров холодного буфера FACS для запуска на цитометре.
Затем используйте сортер клеток для сбора положительных высоких клеток PNA B220 из каждого окрашенного экспериментального образца. Чтобы извлечь ДНК из герминального центра В-клеток или ГКБК, повторно усыпляют клетки в 500 микролитров буфера извлечения ДНК и пяти микролитров протеиназы K.Then осаждают ДНК 500 микролитров изопропанола и один микролитер гликогена. И смешать трубку тщательно, инвертирование его пять или шесть раз.
После инкубации образца в течение 10 минут при комнатной температуре, центрифуга его в течение 15 минут при температуре 21 000G и 25 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы ДНК одним миллилитром 70% этанола. Центрифуга ДНК на 21 000G в течение 10 минут, затем удалить этанол и высушить гранулы в течение пяти-десяти минут.
Повторное образование ДНК в 30 микролитров буфера TE и инкубировать его на ночь при 56 градусов по Цельсию. Выполните вложенный ПЦР для JH4 Intron. Нормализация общего количества геномной ДНК, используемой в первом ПЦР, до наименее концентрированного образца.
После запуска продуктов ПЦР на гель, акциз amplicon и очистить его с гель извлечения комплекта. Затем оспорить ампликсон в плазмиду и преобразовать электро компетентных бактериальных клеток с двумя микролитерами реакции перевязки. Электропорат клетки на 1,65 киловольт и спасти их в 600 микролитров SOC средств массовой информации в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию в трясущимся инкубатором при 225 об/мин.
Плита 100 микролитров преобразованных бактерий на пластины LB агар дополняется ампициллином и инкубировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию. Последовательность плазменной ДНК из бактериальных колоний и выровнять последовательности, полученные для каждого ПЦР против JH4 Intron эталонной последовательности с помощью программного обеспечения Clustal Omega. Определите отличия от эталонной последовательности как мутации.
Клетки герминального центра В были идентифицированы путем измерения экспрессии рецептора B220 и связывания агглютинина арахиса. Патчи дикого типа Пейера содержали в среднем 4 миллиона клеток на мышь. И приблизительно 8% клеток были B220 положительные PNA высокой, что составляет половину того, что наблюдается в AID нокаут мышей.
Из 105 уникальных последовательностей, полученных из диких клеток герминального центра В дикого типа, было обнаружено в общей сложности 226 мутаций. Анализ спектра мутаций показал ряд переходов и транс-версий со скоростью от четырех раз в 10 до отрицательных третьих мутаций на базовую пару. Только две мутации были выявлены в 113 последовательности нокаутом AID.
Кроме того, каждый продукт JH4 PCR из диких клеток герминального центра В дикого типа содержал от одной до 25 мутаций с множественными мутациями, часто обнаруженными на одной последовательности. При попытке этого протокола, не забудьте сохранить клетки на льду, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. После окрашивания клеток, держать клетки в темноте, чтобы предотвратить фотоотлив флюорофоров.
Для корреляции соматической гипермутации с созреванием сродства антител мы рекомендуем использовать протокол иммунизации и анализ на антиген специфические титеры антител и мутации V региона.
