Это первый протокол для генерации желчных кист, обеспечивая систематический анализ, который позволяет оценку образования кисты, эффективности и размера с течением времени. Этот метод позволяет количественно оценить образование эпителиальной кисты, а также позволяет оценить этот процесс как функцию типа эпителиальных клеток или гидрогеля. Поскольку терапевтические возможности для желчных расстройств ограничены, этот протокол открывает двери для стандартизации исследований наркотиков, выявления нормальных терапевтических целей и понимания механизмов заболевания.
Простой метод позволяет решать важные вопросы о механизмах новой информации в рамках биоинженерии трубчатого поля структур. Перед началом эксперимента оттаивать соответствующий раствор гидрогеля при четырех градусах по Цельсию и предварительно остыть пипетки советы и восемь хорошо камеры слайд при минус 20 градусов по Цельсию в одночасье. На следующее утро поместите гидрогель и восемь хорошо камеры слайд на льду и добавить соответствующий объем гидрогеля для холодной нормальной крысы cholangiocyte полной среде, чтобы получить 500 микролитров 40%гидрогеля раствора.
Затем используйте холодные наконечники пипетки, чтобы добавить 50 микролитров гидрогеля раствора в центре каждой колодец камеры слайда и использовать наконечник пипетки для распространения раствора по всей поверхности дна хорошо, как это возможно без пузырьков. Чтобы подготовить клетки к эксперименту, в то время как гидрогель полимеризуется, мыть клетки от 70%-ного слияния нормальной культуры крысы холангиоцитов с предварительно разогретой PBS и инкубировать клетки с пятью миллилитров свежих предварительно разогретых PBS в течение 20 минут в инкубаторе культуры клеток. В конце инкубации замените PBS на один миллилитр предварительно разогретой трипсина-ЭДТА и верните колбу в инкубатор клеточной культуры на 5-10 минут.
Когда клетки отсоединились, нейтрализовать реакцию с четырьмя миллилитров предварительно разогретой полной нормальной крысы холангиоцитов среды и передачи клеток в 15 миллилитров трубки для центрифугации. Затем повторно приостановить гранулы в пять миллилитров предварительно разогретой среды и фильтровать клетки через 40 микрон ситечко в 50 миллилитров трубки для подсчета. Для генерации кист добавьте соответствующий объем гидрогеля к холодной полной нормальной крысиной холангиоцитной среде, чтобы получить 1600 микролитров 80%гидрогеля раствора на льду и разбавить клетки до пяти раз от 10 до пятых клеток на миллилитр холодной нормальной крысы холангиоцитов средней концентрации в 1600 микролитров среднего.
Немедленно смешайте растворы клеток и гидрогеловых клеток и добавьте 400 микролитров клеток к каждой колодец гидрогеля покрытием камеры слайд, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Для обеспечения получения воспроизводимых и значительных результатов, не забудьте справиться с гидрогелем тщательно и тщательно смешать первоначальный раствор водорода ячейки, чтобы получить однородный раствор. Когда все клетки были посеяны, поместите слайд в инкубатор клеточной культуры.
После двух дней в культуре, удалить 250 микролитров среды из одного угла каждой хорошо, заботясь, чтобы не смыть гидрогель, и медленно заменить отбрасываются supernatant с 250 микролитров свежей среды культуры. Для визуализации кисты, в соответствующий день культуры, выберите цель 10 X на фазовом контрастном микроскопе, оснащенном программным обеспечением для получения изображений, включите белую лампу и выберите вариант изображения яркого поля. Выберите игру, чтобы включить камеру и сосредоточиться на поле кист.
Установите время экспозиции и откройте окно папки автоматического захвата, чтобы обеспечить автоматическую экономию изображений. Откройте окно захвата серии, сбросит положение по умолчанию и используйте винт для определения верхних и нижних равнин стека, регулируя шаг в зависимости от цели и уровня разрешения. Затем нажмите запустить сейчас, чтобы начать приобретение.
После визуализации откройте стек на Фиджи. Чтобы дублировать стек, щелкните изображение, дублируйте и дублируйте стек. Для создания проекции минимальной интенсивности из дублируемого стека, под меню изображения, выберите стеки и проект .
Выберите минимальную интенсивность для типа проекции и нажмите хорошо. Чтобы вычесть фон из проекции, в рамках меню процесса, выберите фон вычитания и выберите 500 пикселей радиуса подвижного шара и светового фона, чтобы сделать кисты более контрастными, чем фон. Чтобы измерить приблизительный диаметр кисты, увеличьте целевой кисты, выберите инструмент прямой линии и нажмите кнопку T на клавиатуре.
Нарисуйте линию по диаметру каждой кисты на окончательной проекции. Следующий регион интереса, созданный для каждой кисты, будет добавлен в область менеджера по интересам. Когда все кисты были подсчитаны, нажмите на окно стека, чтобы выбрать его и нажмите показать все, чтобы увидеть подсчитанные кисты.
Перемести курсор вдоль стека, чтобы проверить, что все кисты были подсчитаны в каждом изображении, добавив новые кисты в область менеджера интересов по мере необходимости. Когда все кисты были подсчитаны, выберите область набора интересов и нажмите больше и сохранить, чтобы сохранить данные. Чтобы определить размер каждой кисты, с регионами интересов по-прежнему выбраны, нажмите меру.
Появится окно, в котором перечислены каждая киста и ее предполагаемый размер. Затем сохраните данные в формате CSV. Как было продемонстрировано, запись количества кист и их соответствующих размеров с течением времени позволяет провести анализ эволюции образования и роста кисты.
Жизнеспособность исходной популяции клеток и 10-дневных кист можно оценить с помощью живого/мертвого окрашивания. Мертвые клетки составляют менее 3% населения клеток в день 10 и в основном расположены за пределами кисты, как изолированные клетки или как часть небольших агрегатов, хотя некоторые некротические клетки накопления мусора наблюдается в некоторых крупных кист. Инкубация диацетатом флуоресцеина и хохстом позволяет оценить образование и секрецию флуоресцеина от базального до апического светимого пространства.
Примечательно, что секреция флуоресцентного ингибирования тормозится предварительной обработкой с помощью ингибитора множественной лекарственной устойчивостью, что указывает на то, что флуоресцентное накопление флуоресцентного света связано с секрецией через мультимедикаментозный транспортер, а не утечкой из межклеточного пространства. Окрашивание для экспрессии E-кадхерин показывает, что нормальные крысы холангиоциты поддерживать их эпителиального фенотипа в гидрогеле, по крайней мере 10 дней. При подготовке кисты для оценки иммунофторесценции, сохраняя бычьего альбумин сыворотки на 0,1% или менее во время насыщения является ключом к поддержанию целостности кисты, так как более высокие концентрации приводят к опрокидыванию кисты и люмена краха.
Ночные гидрогель, оттаивание, наконечник пипетки и запись камерного слайда, работа на льду и равномерное распространение однородной клеточной гидрогеликовой смеси на культурную камерную горку имеют решающее значение для экспериментального успеха. Этот метод может быть использован для генерации кист из других эпителиальных клеток или гидрогелей, что позволяет проводить сравнения для лучшего понимания эпителиальной поляризации. Этот количественный метод может быть использован для проверки влияния наркотиков или генетических мутаций на желчные функции и органогенез.
