Разложение жировой ткани на подтипы было сложной задачей, потому что хрупкая природа адипоцитов. Этот протокол был разработан для преодоления этого путем эффективной изоляции одного ядра. Этот рабочий процесс обеспечивает высокоочищенные ядра с минимизированными ядерными агрегатами и клеточным мусором.
Это выгодно для одноклеточного транскрипции профилирования тысяч клеток. Этот простой и надежный протокол может быть применен для изучения ткани уровне организации адипоцитов в их жировой резидентных клеток. И, в частности, к развитию фенотипирования, жирового нокаута и трансгенных мышей.
Визуальная демонстрация этого протокола имеет решающее значение, так что люди, которые не имеют большого опыта в обработке адипоцитов может повторить и понимание жировой неоднородности. После сбора жировой ткани от мышей, погладить его сухим бумажным полотенцем, и поместить его в чистую тарелку. Добавьте хлорид кальция в буфер пищеварения до конечной концентрации 10 мМ.
Затем добавьте небольшой объем в ткань и тщательно измельчите ее. Добавьте около половины подготовленного буфера пищеварения в рубленую ткань. И использовать серологическую пипетку для передачи образца в 50 мл центрифуги трубки.
Вымойте блюдо с оставшимся буфером и добавить его в 50 мл трубки. Pipette образец вверх и вниз несколько раз. Затем инкубировать его в течение 12 до 15 минут при 37 градусах по Цельсию при встряхивании при 200 до 210 об/мин.
После инкубации добавьте 0,5%BSA к выборке при соотношении 1 к 1 объему и хорошо перемешайте с помощью пипетки. Центрифуга образца на 300 xg в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы спина вниз стромоваскулярной фракции оставляя adipocyte фракции на вершине. Фильтр верхней фракции, хотя 400 м клеточный фильтр в 50 мл трубки.
Затем переверните фильтр вверх дном над трубкой и перенесите адипоциты в новую трубку, используя 0,5%BSA для обратного мытья фильтра. Довнесите общий объем BSA до 10 до 15 мл и пипетки образца вверх и вниз с серологическим пипеткой. Затем, центрифуга его снова на 300 xg в течение пяти минут при комнатной температуре.
После центрифугации используйте широкий наконечник пипетки, чтобы тщательно перенести верхний слой образца в 100-метровый клеточный фильтр поверх новой предварительно охлажденной трубки на льду. Промыть фильтр с достаточным количеством буфера подготовки ядер, а затем отбросить его. С этого шага вперед, держать образец на льду и работать быстро.
Оставьте образец на льду на срок до двух минут, периодически инвертирование трубки для смешивания. Затем центрифуга на 1000 xg и 4 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в 1 мл буфера подготовки ядер.
Перенесите образец в чистую микроцентрифугную трубку, чтобы не касаться стен старой трубки. Добавьте 0,6 единицы на ингибитор L RNase и смешайте его. Затем центрифуга образца еще на 10 минут.
Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы и 1 мл буфера мытья ядер. Двойной фильтр образца в чистую трубку с использованием штабелируемых 30 м фильтров. Затем, мыть фильтры с около 300 л ядер мыть буфера.
Чтобы подтвердить успешную изоляцию здоровых ядер, испачкать небольшой aliquot образца с трипаном и использовать автоматизированный счетчик клеток для оценки среднего размера мертвых и процентов мертвых клеток. Пятно в небольшой aliquot образца с DAPI и изучить его под микроскопом с 20X цели или выше. Ядра должны быть круглыми и иметь нетронутую ядерную мембрану.
Белые стрелки указывают на ядра без нетронутой мембраны. После очистки ядер с FACS, сконцентрировать этот образец путем центрифугирования на 500 xg в течение пяти минут при 4 градусах по Цельсию. Затем, восстановить его в соответствующем объеме буфера мытья ядер.
Для достижения концентрации от 50 до 1500 ядер на L и приступить к одноклеточных ядер РНК seq. Для удаления клеточного мусора и дублетов ядра адипоцитов сортируются по размеру и детализации, исключая ядерные агрегаты и мультиплексы. И, наконец, для DAPI положительные события.
Эта стратегия классификации приводит к высокоочищенным одноядерам с минимальными агрегатами и мусором. При осмотре с помощью микроскопии отсортированные ядра должны быть круглыми и иметь неповрежденную мембрану. Успешная очистка ядер также может быть выполнена с помощью qRT-PCR в режиме реального времени с использованием грунтовки для зарождающейся мРНК Ucp1, маркерного гена коричневых адипоцитов.
Хромовая платформа определила транскриптом 7500 ядер из муриной межкапулярной коричневой жировой ткани. Семь различных типов клеток были выявлены с t-SNE уменьшение размерности и k-средств кластеризации. Все кластеры, выраженные Fabp4, ген пан адипоцитов и подмножество выразили высокий уровень ОГП1 мРНК.
Ядра изолированы, а затем подтвердил, хотя этот протокол может быть подвергнут практически любой одноклеточного уровня экспрессии генов платформы, включая хром из 10x геномики.
