Этот протокол позволяет отслеживать и количественно проводить оценку деградации белка, представляющих интерес для живых и стареющих C.elegans. Этот виво и неинвазивный метод требует лишь небольшой микроскопии, настроенной для надежного преобразования Dendra2 в яркий и стабильный флюорофор. Метод адаптируется к системам млекопитающих, а также зебрафиш.
Для изучения, положить в оборот в сети протеостатис, а также транспорта и торговли людьми. Позаботьтесь, чтобы не спровоцировать нежелательное преобразование Dendra2 во время сканирования с помощью синего светового лазера, а также проверить и оптимизировать настройки приобретения и настройки преобразования для каждой системы и белка синтеза. Начните с выращивания возрастных нематод при 20 градусах Цельсия до желаемого возраста для эксперимента.
В день эксперимента по визуализации растопить агарозу общего сорта при концентрации 3% в двойной дистиллированной воде. В то время как агароза охлаждается, вырежьте кончик наконечника одноми миллилитров пипетки, чтобы облегчить стремление приблизительно 400 микролитров расплавленной агарозы. Аккуратно добавьте несколько капель агарозы на чистую стеклянную горку и сразу же поместите еще один слайд поверх капель, чтобы создать тонкую площадку агарозы между двумя стеклянными кусочками.
Когда агароза высохнет, аккуратно удалите верхнюю горку. Когда будет подготовлено достаточно слайдов, откройте программное обеспечение конфокального микроскопа и установите путь света для возбуждения и выбросов. Для зеленого Dendra2 добавить от 486 до 553 нанометров, а для красного Dendra2 добавить 580 до 740 нанометров.
Отрегулируйте мощность и увеличение обоих каналов в зависимости от интенсивности фторфора и установите пинхол, чтобы полностью открыть. Выберите последовательный режим канала и установите трек для переключения каждого кадра. Установите режим сканирования в качестве кадра и размер кадра как 1024 к 1024 году с шагом строки одного.
Установите усреднение до двух и в среднем по среднему методу и режиму однонаправленной линии. Установите глубину бита до восьми битов. Определите многомерную настройку приобретения для преобразования Dendra2.
Для преобразования и отбеливания используйте 405 нанометровый диодный лазерный набор на 60% энергии. Выберите промежуток времени из двух циклов с интервалом в 0,0 миллисекунды между циклами и нормальным началом и остановкой. Установите отбеливание, чтобы начать после сканирования один из двух, повторить в течение 30 итераций и остановить, когда интенсивность падает до 50%Затем, определить скорость приобретения пикселя жить быстро для преобразования и среды для захвата оснастки изображения.
Чтобы смонтировать нематод на слайдах, используйте постоянный маркер, чтобы нарисовать и номер окна с четырьмя квадратами на противоположной стороне агарозы площадку на каждом слайде. Добавьте 15 микролитров левамизола к середине агарозной площадки и используйте стерео микроскоп и проволочный выбор для переноса для возрастных нематод в каплю. Используйте ресницы забрать аккуратно переместить каждый нематод в одно окно площади.
Когда все нематоды были перемещены, подождите, пока черви перестали двигаться, прежде чем поместить крышку скольжения над жидкостью, чтобы обездвижить нематод во время изображения. Затем поместите слайд на стадию конфокального микроскопа. Для зеленого преобразования Dendra2 используйте окуляр цели 20 X под зеленой флуоресценцией, чтобы найти первый нематод и сосредоточиться на голове или хвосте.
Переключитесь в конфокальный режим и увеличьте или уменьшите прирост и мощность лазера, чтобы получить насыщенное, но не переэкспонированное изображение. Нарисуйте область интереса вокруг выбранного нейрона и нарисуйте вторую большую область интереса вокруг хвоста, которая включает в себя первую область интереса. Установите первый регион, который будет приобретен, отбеленные, и проанализированы.
Установите второй регион, представляющий интерес для приобретения и анализа, но не отбеленный. Установите скорость сканирования до максимума и начать сканирование для преобразования выбранных нейронов Dendra2. Сразу же после преобразования, начать живое сканирование с зеленым 561 нанометровый лазер, чтобы визуализировать Dendra2 в красном канале и найти фокус и соответствующие максимальные проекции преобразован нейрона.
Быстро установите скорость сканирования на более низкую скорость обитуемого пикселя и приобретете моментальный снимок обоих каналов с более высоким разрешением. Это изображение считается нулевым по времени после преобразования. Затем сохраните сканирование с идентифицируемым именем и или номером, за которым последует метка времени ноль.
Чтобы отслеживать деградацию Dendra2 с течением времени, откройте нулевое изображение соответствующего нейрона нематод. Используя ту же настройку изображения, начните сканирование в прямом эфире в красном канале и привнесите преобразованный красный нейрон в фокус. Затем, не изменяя никаких параметров приобретения, получить снимок с той же скоростью, что и первое изображение.
Не забудьте тщательно определить настройки конверсии, чтобы преобразовать Dendra2 эффективно и достаточно и поддерживать те же параметры приобретения в разных точках времени. Чтобы проанализировать преобразованные изображения Dendra2, откройте изображения нулевой и второй точки времени на Фиджи и откройте измерения анализа и набора. Выберите функции Area и Integrated Density и выберите изображение, полученное с помощью красного канала.
Используя инструмент выбора полигонов, нарисуйте область интереса вокруг нулевого преобразованного нейрона времени. Чтобы правильно определить контуры нейрона, выберите изображение, настроить и порог, чтобы подчеркнуть пороги интенсивности. После того, как выбор был определен, нажмите Анализ и измерения.
Появится всплывающее окно результатов, включая область, интегрированную плотность и необработанные интегрированные значения плотности для выбранного региона, представляющий интерес. Выполните тот же процесс отбора и измерения изображения со второй точки времени. Затем скопировать значения в электронную таблицу.
В этом репрезентативном анализе перед преобразованием не было видно красного сигнала, когда образец был возбужден в красном канале. После облучения зеленый сигнал уменьшился по мере того, как HTT-D2 был преобразован, и впоследствии появился красный сигнал. Выражение HTT-D2 деградировало с течением времени, что привело к снижению уровня красного сигнала HTT-D2 и возможному увеличению зеленого сигнала HTT-D2 по мере того, как вновь синтезировался больше белка синтеза.
Примечательно, что нейроны хвостовой области были определены как значительно более активные по сравнению с нейронами головы. Кроме того, произошло значительно больше деградации контроля HTT-25-D2 через 24 часа после преобразования, затем через два часа как в головных, так и в хвостовых нейронах. Эта разница не наблюдалась в патогенных HTT-97-D2, однако, предполагая, что протеостаз сети не смог удалить HTT-D2, содержащий больше глутамина тянется по всей нервной системе.
HTT-97-D2 не деградировал так же эффективно, как HTT-25-D2 в очень старых нематод, подчеркивая неспособность сети протеостаза для удаления агрегированных и, возможно, токсичных видов Хантингтина у пожилых животных. Важно отметить, что хвостовые нейроны были в состоянии справиться с токсичными HTT-97-D2 в молодых нематод, предполагая, что различные сопутствующие протеостаз сетевые механизмы могут быть на работе, чтобы удалить HTT-D2. Для каждого образца приобретают и не переэкспонированные и ненасыщенные изображения сразу после преобразования и повторно использовать тот же параметр для этого образца во времени.
С помощью этого протокола можно протестировать изменения в сети протеостатис, а также, с помощью микроскопии супер-разрешения, отслеживать распространение связанных с болезнью белков.
