Используя этот протокол, мы можем рассмотреть ключевые вопросы о том, как микробы собираются и взаимодействуют в филлосфере. Он имеет дополнительное преимущество, что с помощью стерильного растительного экстракта, мы можем связать структуру филло сферы общин их функции во время растительного брожения. Эти методы позволяют ученым проверить, как микробы взаимодействуют в сфере филло, а затем отслеживать, как эти сообщества сферы филло могут повлиять на брожение.
Для поверхности стерилизовать семена капусты, начните с размещения 100 семян в 1,5 миллилитров микро центрифуги трубки. Добавьте один миллилитр 70%этанола в трубку и вихрем его в течение пяти минут. Затем используйте пипетку, чтобы отказаться от этанола.
Добавить один миллилитр 50%отбеливатель и вихрь трубки в течение пяти минут, а затем отказаться от отбеливателя. Промыть семена четыре раза, добавив один миллилитр autoclaved деионизированной воды вихри трубки, а затем отбрасывая воду. После последнего полоскания замочите семена в стерилизованной деионизированной воде в течение двух-восьми часов, чтобы смягчить семенной слой перед посадкой.
Взвесите 10 граммов чистой глины кальция в стеклянную трубку 15 на 2,5 сантиметра. Добавьте приблизительно 9 миллилитров подготовленного бульона MS к каждой пробке для того чтобы покрыть кальциевые глины. Свободно крышка стеклянные трубки с 22 миллиметров в два пути пробирки шапки.
Автоклав труб при 121 градусе по Цельсию в течение 60 минут. При удалении трубок из автоклава, нажмите шапки на стеклянные трубки, чтобы запечатать их, а затем охладить трубки до комнатной температуры перед использованием. Когда трубки остыли, использовали дополнительные длинные типсы, чтобы аккуратно поместить одно стерильное семя капусты в центр каждой трубки.
Кружева трубки в семь лоток и поместите лоток под свет стеллажи с 16-часовой световой цикл при 24 градусов по Цельсию. Семена будут развиваться их первый истинный лист через пять дней, который является первым сосудистым листом после cotyledons сформировались. Он имеет морщинистую кромку и покрыт трикомбами.
Чтобы проверить капусту без микробов на бесплодие, аккуратно схвяйте основание растения стерилизованными типсами и вытащите его. Перед тем, как полностью удалить капусту из трубки, аккуратно отрежьте корни стерилизованными ножницами для вскрытия. Затем уплотняете листья капусты в 1,5 миллилитровую микро центрифугу.
Добавьте 400 микролитров PBS к каждой микро-центрифуге трубки и использовать стерильный микро пестик для гомогенизации капусты. Лезвие 100 микролитров капусты гомогената на агар пластины, убедившись, что использовать широкий кончик отверстия пипетки. Чтобы сделать запасы глицерола инокуляции штаммов, осторожно полоса из отдельных колоний на две или три новые пластины одного и того же средства массовой информации.
Строка колоний в течение двух-пяти дней, а затем соскребать их из пластин в 15 миллилитров конической трубки с 15 миллилитров 15%глицерол. Vortex трубки тщательно перемешать. Aliquot один миллилитр смешанного глицерола в микро центрифугу трубки и хранить его 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию вместе с остальными 14 миллилитров глицерола фонда.
За неделю до использования оттаивать один миллилитр aliquot на льду и поместить его на несколько различных разбавлений для определения концентрации прививки фонда. Когда готовы привить капусту, разморозить запас глицерола на льду и разбавить его до нужной концентрации. Добавьте 10 миллилитров разбавленного бульона в стерильную бутылку насоса и накачайте пять спреев в большой стакан для сбора отходов.
Снимите крышку с капустной трубки и наклоните капусту к бутылке спрея. Спрей каждой капусты с тремя насосами прививки раствора, а затем собрать подмножество капусты для оценки фактической концентрации входной прививки. Чтобы собрать капусту, удалите ее из трубки с стерилизованными типсами.
Отрежьте корни стерильными ножницами для вскрытия и аккуратно поместите их в предварительно взвешенную стерильную трубку микро центрифуги. Запись веса капусты для будущих расчетов. Добавить 400 микролитров PBS к каждой трубке с капустой и измельчить его 30 раз с микро пестика, а затем пластины капусты гомогената с помощью широкого отверстия пипетки советы.
Удалите и отбросьте внешние листья капусты и нарежьте всю оставшуюся капусту, чтобы поместиться в блендер. Смешайте его с тонкой мякотью и взвесить гомогенат капусты. Добавьте два миллилитров дистиллированной воды на грамм капусты.
Затем фильтровать капусту суспензии через два слоя корзины фильтры кофе. Обойти суспензию в центрифугу труб и центрифугировать его в 20 000 раз G в течение 20 минут или до тех пор, пока крупные частицы оседают из раствора. Удалить супернатант, заботясь, чтобы не беспокоить гранулы капусты мусора.
Чтобы воссоздать условия брожения со стандартными концентрациями соли, добавьте к экстракту 2%-ный вес хлорида натрия. Bilder овощной экстракт с 0,2 микрометрового фильтра прилагается к вакууму, обойтись его в стерильные трубки и заморозить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Метод стерилизации семян был протестирован с несколькими капустой Напа, и все они продемонстрировали аналогичные темпы роста.
Тем не менее, другие виды brassica дал ограниченный успех, потому что растения либо были низкие темпы прорастания после стерилизации или стволовые удлиненные быстро, чтобы сделать spindly нездоровое растение. Микробные изоляты были привиты либо как одиночные изоляты штамма, либо в сочетании с другим изолятом. В общей сложности 15 капуст без микробов были протестированы для каждого лечения и собраны либо немедленно, в течение четырех дней или через 10 дней после прививки.
Изоляты продемонстрировали быстрый рост в напа капусты Phyllosphere. Два дрожжа и три бактерии были привиты в три различных типа стерильного растительного экстракта или SVE из красной, зеленой и капусты Напа. Рост прививки был зарегистрирован в течение 14 дней путем точечного покрытия пяти микролитров каждого лечения либо на MRS или YPD агар пластин.
Измерения рН на протяжении всего брожения показали, что молочнокислые бактерии были способны подкисления SVE до уровня ниже рН четыре, что свидетельствует о брожении, что является безопасным для потребления. Эти методы специально применяются к микробиому капусты, но могут быть полезны в других системах растений. Это может быть сложной задачей, чтобы сохранить систему стерильной, наши протоколы набросков подробно, но мы обнаружили, что каждый шаг будет иметь важное значение.
