С оптогенетической манипуляции конкретных популяций нейронов или областей мозга, поведение может быть изменено с высоким временным и пространственным разрешением в свободно движущихся животных. С помощью различных оптогенетических инструментов в сочетании с хронически имплантированных оптических волокон, различные нейрональные модуляции и поведенческие испытания могут быть выполнены. Конечной целью оптогенетики является модуляция нейронных схем с высоким временным и пространственным разрешением в поведении животного.
В отличие от фармакологических или электрических манипуляций, оптогенетика позволяет точно контролировать конкретные типы клеток на нейронных схемах. Оптогенетика является идеальным способом таргетинга на конкретные типы клеток в специально определенной области во время поведения, а также для изучения прямого воздействия изменений в таких микрокругов. Теперь мы представят шаг к шагу руководство, как подготовить и растений и проведения оптогенетики в свободно движущихся мышей.
Для подготовки оптического имплантата поместите керамическую феррульную плоскую сторону вверх в скамейку тися. Стрип код 200 микрометрового диаметра стеклянного волокна, с волокном зачистки инструмент и сократить два-три сантиметра, не куски с керамическим волокном писца. Поместите кусок стеклянного волокна в керамический феррул затем поместите каплю суперклея на плоской стороне с инъекцией канюрной.
На круглой стороне керамического феррула, вырезать стекло волокна как можно короче и место предварительной имплантата на феррул полировки шайбу для полировки круглой стороне на четырех различных издательских работ. После этого вырежьте стеклянное волокно на плоской стороне керамической феррулы, до длины, необходимой для имплантации. Используйте атлас мозга мыши для расчета длины имплантата.
Имплантат должен закончиться непосредственно над областью интересов. Перед имплантацией применяется анестезия. Точная и эстетическая техника описана в рукописи.
Когда мышь достигнет глубокого состояния анестезии, поместите ее на нагревательной пластине и зафиксируете голову в стереотаксической раме. Зафиксните нос и зубы спереди и уши с обеих сторон. Нанесите algesia с cuprofen subcuntaneously в заднюю часть мыши и нанесите непрозрачную мазь глаза на обоих глазах для того чтобы защитить их от сушить.
Смочить волосы на кожу головы с мокрым бумажным полотенцем, а затем отрезать его с помощью ножниц. Убедитесь в том, чтобы удалить все свободные волосы с мокрым бумажным полотенцем. Используйте хлопчатобумажную палочку для дезинфекции кожи головы настойкой, содержащей йод.
Поднимите кожу головы о области интереса с помощью пинцета и вырезать один сантиметр вдоль средней линии. Чтобы roughen черепа для имплантации, применить небольшое количество фосфорной кислоты на шрам и дайте ему в силу в течение 15 секунд. Удалить все кислоты с ватной палочкой и промыть шрам хлоридом натрия в два раза.
Для правильной инъекции вычислите коэффициент F для отдельных координат. Поместите стеклянную канюлярную в стереоктатической раме и найдите ее прямо над брегмой. Теперь обнулить систему координат и переместить стеклянную канюлю в Ламбду.
Рассчитайте коэффициент F по следующей формуле. Брегма минус Ламбда делится на 4,2 равно F-фактору. Точные координаты очень важны для инъекций и имплантации, потому что в противном случае, если неправильная структура стимулируется, то поведенческие эффекты являются неспецифическими.
Все мыши имеют минимальные отклонения в размере черепа, поэтому коэффициент абсолютно обязательный. Используйте скорректированные координаты, чтобы найти расположение на шраме непосредственно над структурой интереса. Используйте инъекционную канюлю, чтобы просверлить отверстие в черепе, вращая канюлю на месте.
Чтобы взять раствор вируса в стеклянную канюлю, соединенную со шприцем, поместите каплю хлорида натрия на череп и кусок пирофена сверху. Поместите каплю двух растворов вируса микролитеров на пирофен и опустите кончик стеклянной канюли в вирус. Нанесите отрицательное давление и подождите, пока раствор вируса не будет взят канюлей.
Ноль, чтобы координировать, когда кончик вируса с канюлей находится на уровне черепа и медленно опустите его в скважину в нижней позиции стороны инъекции. Нанесите шприцем небольшое количество положительного давления до тех пор, пока мениск не будет опущен. Пусть вирус распространяется в течение двух-трех минут, прежде чем двигаться стеклянной канюлей вверх в следующее положение.
Удалите стеклянную канюлю очень медленно и отбросьте ее после окончательной инъекции. Теперь подготовь череп к имплантации. Высушите череп сжатым воздухом, нанесите грунтовка соответствующей палкой и дайте ей высохнуть в течение 15 секунд.
Нанесите связь с той же палкой и вылечить его в течение 20 секунд с ультрафиолетовым светом. Поместите имплантат в соответствующий держатель и распоимите кончик стеклянного волокна прямо над скважиной и аккуратно опустите его. Прекратите опускать имплантат, когда оставшийся клапан суперклея коснется черепа.
Имплантация оптических волокон также может быть сделана для двусторонних структур, таких как гиппокамп. Это позволяет легкой стимуляции в обоих полушариях в то же время или позволяет стимуляции двух различных структур. Кроме того, можно вводить вирус в месте, отличается от оптического волокна имплантата.
Если инъекция и имплантация проводится в разных регионах, просверлите все необходимые отверстия после нанесения фосфорной кислоты, но до двух компонентов адгезии. Проверьте еще раз, если череп все еще полностью сухой, а затем применить жидкость зубного цемента вокруг имплантата и в окрестностях, то вылечить в течение 20 секунд с ультрафиолетовым светом Применить еще два меньше цемента в полностью мех бесплатно и сушеные области черепа. Лечить каждый слой с ультрафиолетовым светом.
Для завершения операции нанесите помазание йодом на всю рану. Отпустите фиксацию носа и уха, принесите мышь в свежую клетку и поместите ее под нагревательной лампой, чтобы избежать потери тепла тела. Проверьте его состояние здоровья по крайней мере один раз в день, и он будет размещать оперативной и algesia через три дня, если это необходимо.
После двух недель восстановления мышей можно использовать для поведенческих экспериментов. Откройте программное обеспечение Pulser и выберите порт USB com, в который подключен источник света. Выберите режим работы 3, чтобы позволить внешнему программному обеспечению управлять источником света.
Выберите правильную регулировку для стимуляции 20 Герц с пятимисекундным световым импульсом. Чтобы найти деление для связи с пульсатором, нажмите на последовательность запуска. Этот статус будет сохраняться до завершения экспериментов.
Теперь создайте новый эксперимент в EthoVision XT, идите в файл, выберите новый шаблон и выберите применить заранее выбранный шаблон. Выберите живое отслеживание и выберите камеру с источником и подтвердите подключенную камеру Puslar Gen-Eye. Выберите мышь в качестве животного, которое должно быть записано.
Выберите шаблон арены, открытый квадрат поля и центр шаблона зоны, границу, углы. Подтвердите один предмет, который должен быть отслеирован и выбрать центральную точку, точку носа и хвостовую базу. Подтвердите цвет животного по сравнению с фоном темнее и рекомендуемая скорость выборки, чтобы закончить шаг.
Назовите эксперимент подходящим и выберите место для сохранения. До тех пор, пока вы не найдете настройки арены, камера автоматически откроет фоновое изображение. Адаптируйте предопределенные зоны к реальной арене, используя стрелку и два символа на ней справа.
Если некоторые зоны не нужны, удалите их. Нажмите нарисовать шкалу для калибровки и поставить линию из одного угла лабиринта в другой. Введите длину реального расстояния в сантиметрах.
Повторите это для другой оси. Чтобы определить параметры пробного управления, подготовьтесь к основному правилу, отрегулив время времени времени до 20 минут. Условием для Star Trek должно быть, когда объект находится на арене в течение двух секунд, для автоматического состояния отслеживания, когда мышь находится на арене.
Чтобы создать под правило для стимуляции света, перейдите к структурам, больше и выберите к югу правило. Поместите его ниже основного правила и разложить две коробки. Перейти к условиям, времени и дать ему имя, как свет на один, настроить условие встретился с через пять минут.
Поместите поле прямо за окном правила начала под правилом. Перейти к действию пользовательского оборудования и назвать его со светом на одном. Выберите действие для выполнения как:Я положу один высокий.
Поместите коробку прямо за окном состояния. Повторите шаги, чтобы запрограммировать свет, чтобы в свете на. Теперь перейдите к структурам, ссылке на подправимое правило и убедитесь, что ссылка принадлежит правильному подправе.
Выберите условия начала, как без задержек, и условия запуска, как выполнить один раз в состоянии запуска. Поместите справочную коробку между дополнительными книгами один и условие книги два из основных правил. Теперь определите параметры обнаружения, чтобы показать системе, что она должна отслеживать.
Поместите тестовые мили на арену и выберите автоматизированную установку. Выберите грызунов в качестве животного типа и использовать курсор мыши, чтобы нарисовать коробку вокруг мышей на арене. Подтвердите результаты вопроса ухода с да.
Для эксперимента на открытом поле, принести экспериментальную мышь в комнату поведения прямо перед экспериментом, чтобы обеспечить надлежащий уровень тревоги. Пара мышь быть щель источника света, нажав его осторожно к сетке клетки. Поместите его в клетку ожидания со свежим мусором в течение 10 минут, чтобы акклиматизироваться к световому кабелю.
Начните приобретение, нажав кнопку остановки, и вы видите XT. Перенесите мышь из клетки ожидания в левый верхний угол открытого поля. Оставьте поле зрения мыши во время эксперимента и сохраняйте спокойствие. Через 20 минут, когда эксперимент будет закончен, удалите мышь из лабиринта, отключите световой кабель и поместите его обратно в собственную клетку.
По визуализации проверки, различия в центре времени между выключенным светом и светом на лицах можно непосредственно увидеть. Мышь проводит меньше времени в центре, когда свет на. Для эксперимента в лабиринте Барнса, принесите всех экспериментальных мышей в комнату поведения примерно за час до эксперимента.
Подготовь лабиринт Барнса, закрыв все отверстия, кроме одного, и теперь, когда окно побега помещается. Соедините одну мышь в источнике света на обоих имплантатах и поместите ее прямо в середину лабиринта Барнса. Нажмите начать и нужно посетить следующий T и удалить коробку.
Будьте готовы остановить пробную версию вручную на случай, если программное обеспечение не распознает весь переход. Вынюхи мышь из лабиринта и удалите соединение с световым кабелем. При выполнении, обучении и задаче памяти изучается не только непосредственный эффект манипуляции, но и долгосрочный эффект манипуляций при приобретении, консолидации или извлечении.
Для анализа данных, вы найдете лечение состояние лечение лечение или контролируется, перейдите к гнездования и выбрать состояние пробного контроля. Выберите интервал состояния от действия элемента Star Trek к свету действия элемента идет на одном. Поместите гнездовую коробку между обработкой фильтровальной коробки и соответствующей коробкой результатов.
Этот определенный интервал один. Повторите шаги для интервалов на одном из двух и на двух, а также для контрольной группы. Также определите параметры для анализа в профиле анализа.
Выберите зависимую переменную в зоне и выберите центр зоны, точку тела, центральную точку и перейдите на пробную статистику. Выберите частоту, кумулятивную продолжительность, и пусть там, чтобы увидеть первый. Кроме того, добавить расстояние двигаться в качестве переменной.
С помощью этого профиля доступны данные о времени, проведенном в центре, записи в центре и сказано на расстояние перемещения. Чтобы извлечь данные из каждого подразделения, перейдите к результатам и выберите статистику и диаграммы, нажмите вычислить, чтобы увидеть проанализированные данные. Нажмите данные об экспорте и выберите статистику испытаний и местоположение для сохранения.
Экспортируемые данные сохраняются как файл Excel и с индивидуальными значениями для каждой мыши. Кроме того, перейдите на визуализацию тепловой карты и нажмите карты тепла участка, выберите испытания справа, чтобы увидеть отдельные карты тепла для каждой мыши и суда. Сделайте правильный щелчок на мышь и экспортировать тепловые карты в качестве изображений.
Позже откройте файл Excel компьютер и вычислите средние и стандартные евро SCM для всех четырех испытаний и каждой измеренной группы кондиционирования. Для генерации графиков и сюжета Sigma скопировать средства и СКМ в правильный порядок из дополнительного файла в сюжет Sigma. Строки должны содержать данные для от одного, на одном, и столбцы содержат пробную версию, среднее и SCM герц.
Выберите все три столбца и перейдите к созданию графиков. Выберите барную коробку и выберите негруппированную коробку со стрелкой. Наклеить этикетку весь график, идти домой, выбрать граф поле и нажмите экспорта.
Выберите папку назначения и выберите мета-файл в качестве формата. Для расчета статистики полученных данных скопировать правильные данные Xcel можно по одному и так далее, а также в отдельные столбцы сюжета Sigma. Отметите столбцы, которые вы хотите сравнить и перейти к анализу, выберите тест T и нажмите запустить.
Наконец, поведенческие данные могут быть показаны разделенными на let off и на пробе с дополнительной специализацией тепловой карты. В эксперименте на открытом поле, во время стимуляции света Channelrhodopsin2 и пирамидальных нейронов, продолжительность центра снижается, что указывает на повышенный уровень тревоги. Через иммуногистохимию, место инъекции и экспрессию вируса можно определить, также при специфике на специальной крем-зависимой линии мыши могут быть проверены.
Можно ясно видеть, что свет стимуляции Channelrhodopsin2 улучшить нейроны ума этой конкретной области коры увеличивает уровень тревоги, по сравнению с базовым беспокойством до этой стимуляции. Это непосредственное влияние манипуляции на поведение является причиной, почему оптогенетические используется сегодня так много вопросов исследования, касающиеся поведения. Эта процедура может быть использована для оптогенетической модуляции любого желаемого типа клеток или нейрональной схемы в мозге мыши.
Объединив эту процедуру с подходящими поведенческими тестами для ваших исследований, можно получить более глубокое понимание нейронных схем, участвующих в поведении и заболеваниях, представляющих интерес.
