Анализ перевязки близости позволяет пользователям обнаруживать белково-белковые взаимодействия на месте, выявляя пространственные и временные закономерности взаимодействий. Этот метод может помочь ответить на важные вопросы о регулировании развития C.elegans. Этот метод предлагает сопоставимую чувствительность для обнаружения белково-белковых взаимодействий без сложности других методов, таких как FRET и BiFC.
Лица, которые никогда не вскрыли червей, чтобы освободить гонад может бороться с этим шагом. Практика вскрытия червей, и использовать их для иммунофторесценции для ссовершенства обработки и вскрытия методов, прежде чем перейти к НОАК. Для начала выберите от 30 до 40 молодых взрослых червей в стеклянное блюдо часов, содержащее 500 микролитров 1x M9 и левамизола.
После сбора червей, тщательно удалить и отказаться от большинства средств массовой информации для удаления бактерий, которые передаются вместе с червями. Добавить в свежие 500 микролитров 1x M9 и levamisole, и использовать пипетку, чтобы аккуратно составить и обойтись средств массовой информации для полоскания червей. Тщательно удалите и отбросьте большинство средств массовой информации.
Повторите стирку два-три раза. После мытья оставьте червей примерно в 100 микролитров мультимедиа не более чем на восемь минут. Используя стеклянную или полиэтиленовую пипетку, перенесите червей на слайд микроскопа 25 на 75 миллиметров, покрытый 001%-l-лизином.
Удалите излишки мультимедиа так, чтобы на слайде осталось около 15 микролитров мультимедиа. Удаление избыточного буфера имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы расчлененные черви и гонады придерживались слайда. Под рассечением микроскопа, с двумя 26 1 /2-го калибра иглы, место одной иглы над другой так, что концы образуют ножницы.
Используя иглы, ориентированные таким образом, вырезать червей за глотки, чтобы освободить зародыши. Рассекаете всех червей в течение пяти минут. После того, как все черви вскрыты, аккуратно поместите 22-миллиметровый на 40-миллиметровый крышку над слайдом так, чтобы он перпендикулярно слайду.
Концы крышки должны свисать с горки. Заморозить слайды на предварительно охлажденной алюминиевой блок поддерживается на сухом льду, по крайней мере 20 минут. Аккуратно поместите охлажденный карандаш поверх крышки, чтобы предотвратить крышку от становится свободным из-за расширения льда.
Когда вы будете готовы к фиксации, стряхните крышки карандашом и немедленно окуните слайд в банку со свежим, ледяным метанолом в течение одной минуты. Затем аккуратно протрите края слайда, окружающего образец, и нанесите 150 микролитров формальдегида фиксации при комнатной температуре, чтобы исправить в течение пяти минут. Прикоснитесь к слайду на бумажное полотенце под перпендикулярным 90-градусным углом, чтобы фиксатор убежал с горки и впитался в бумажное полотенце.
Блокируйте горки дважды в течение 15 минут при комнатной температуре в банке Coplin с 50 миллилитров PBT/BSA. Затем блокируйте слайды раствором PBT/BSA, содержащим 10%-нормальную козлиную сыворотку. Аккуратно протрите края, которые окружают слайд, и нанесите 100 микролитров раствора на каждый слайд.
И осторожно агитировать слайд, чтобы помочь распространить решение. Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре во влажной камере. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы раствор убежал слайд, и аккуратно протрите края.
Чтобы заблокировать горки, нанесите одну каплю блокирующего реагента на пространство 14 на 14 миллиметров. Инкубировать горки в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию во влажной камере. Поместите слайды на бумажное полотенце, чтобы блокирующий реагент убежал с горки, и аккуратно протрите края.
Используйте разбавляющие антитела, чтобы разбавить первичные антитела. Нанесите на слайды 40 микролитров разбавленного раствора первичного антитела на 14-на-14-миллиметровое пространство. Поместите горки во влажную камеру и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию.
Утром мыть горки дважды в течение пяти минут, каждый с 50 миллилитров 1x мыть буфера при комнатной температуре в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный шейкер, установленный до 60 об/мин. Поместите слайды на бумажное полотенце, чтобы вымыть буфер убежать слайд, и аккуратно протрите края.
Подготовь 40-микролитровый раствор, содержащий зонды плюс и минус. Добавьте раствор к каждому пространству 14 на 14 миллиметров. Инкубировать горки во влажной камере в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию.
Вымойте слайды дважды в течение пяти минут каждый с 50 миллилитров 1x мыть буфер при комнатной температуре в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный шейкер, установленный до 60 об/мин. Разбавить буфер перевязки от одного до пяти с ультрапурной водой.
Используйте этот буфер, чтобы разбавить лигазы от одного до 40, чтобы подготовить рабочий запас решения перевязки. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы вымыть буфер убежать стороны, и аккуратно протрите края. Добавьте 40 микролитров раствора перевязки в каждое пространство 14 на 14 миллиметров.
Инкубировать горки во влажной камере в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. После мытья и сушки слайдов, как описано ранее, добавьте 40 микролитров свежеприготовленного раствора усиления, защищенного от света, в каждое пространство 14 на 14 миллиметров. Инкубировать горки во влажной темной камере в течение одного часа и 40 минут при 37 градусах по Цельсию.
Вымойте слайды дважды в течение 10 минут каждый с 50 миллилитров 1x мыть буфер B, и мыть слайды один раз в течение одной минуты с 50 миллилитров 01x мыть буфер B.After сушки эпоксидной покрытием периметр слайда, добавить 10 микролитров монтажной среды для каждого образца, и аккуратно заложить крышку сверху, что позволяет для среднего монтажа распространяться. Краска вокруг края крышки с лаком для ногтей, чтобы запечатать крышку и слайд. Избегайте перемещения крышки.
Пусть лак для ногтей затвердеет, по крайней мере 20 минут при комнатной температуре, защищены от света. Со-иммуностайтирование зародышей с антителами FLAG и GFP выявило их закономерность экспрессии в зародышевой линии. В то время как GFP был выражен по всей зародышевой линии, выражение OMA-1:GFP было ограничено поздним пахитеном и ооцитами.
FLAG иммуностай показывает, что 3xFLAG:DLC-1 был выражен по всей зародышевой линии в обоих штаммов. Область интереса для количественной оценки НОАК в зародышевой линии охватывает поздний пахитен через ооциты во всех зародышах. Это область выражения ОМА-1.
3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP зародыши, как представляется, большее количество очагов НОАК в этом регионе по сравнению с 3xFLAG:DLC-1, GFP зародышей. Убедитесь, что есть достаточно воды, чтобы поднять влажность в камере. Кроме того, убедитесь, что слайды находятся на уровне внутри камеры, чтобы предотвратить сток реагентов.
После анализа перевязки близости экструдированная гонада может быть изображена на конфокальных микроскопах и количественно определена с помощью рабочего процесса Фиджи, ImageJ. Эта количественная оценка может помочь определить, является ли взаимодействие статистически значимым. НОАК позволила нам оценить взаимодействие на месте между критическими регуляторами развития зародышевой линии нематод.
