Иммунные рецепторы NLR играют решающую роль в посредничестве защиты растений от различных патогенов. Мы описываем метод маркировки близости на основе TurboID для идентификации партнеров по взаимодействию домена рецепторов Toll/interleukin-1, содержащего НЛР, таких как иммунные рецепторы в растениях Nicotiana benthamiana. Этот протокол обеспечивает важную ссылку для изучения белково-белковых взаимодействий в других видах растений и может быть распространен на любой белок, представляющий интерес в Никотиана бентамиана.
Подход к маркировке близости на основе TurboID имеет явное преимущество перед традиционными подходами, поскольку он может быть использован для захвата переходных или слабых белково-белковых взаимодействий in vivo. Начните с выращивания семян N.benthamiana во влажной почве при высокой плотности. Поддерживайте их в климатической камере с 18-часовым светом и восьмичасовым темным фото периодом при 23-25 градусах Цельсия.
Держите растения в камере около четырех недель, пока они не вырастут до стадии листа от четырех до восьми для последующей агроинфильтрации. Построить TurboID слияний и превратить плазмиды в Agrobacterium tumefaciens компетентных клеток, как описано в текстовом протоколе. Используйте один миллилитр без иглы шприц, чтобы проникнуть в инокулум абаксиального эпидермиса полностью зрелых листьев N.benthamiana.
В 36 часов после фильтрации, проникнуть 200 микромоляных биотина в листья и поддерживать растение в течение еще трех-12 часов до сбора листьев ткани. Чтобы собрать образец листа, вырезать проникли листья у основания петиола, удалить вены листьев, и вспышки заморозить ткани в жидком азоте. Измельчить ткани листьев с пестиком и раствором и хранить порошок в 15 или 50 миллилитров Сокол трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Чтобы извлечь общий белок, перенесите около 0,35 грамма листового порошка в двухми миллилитровую трубку. Будьте уверены, чтобы поддерживать ткани при низкой температуре в жидком азоте во время этого процесса. Добавьте в порошок 700 микролитров буфера лиза RIPA.
Вихрь трубки в течение 10 минут и оставить образец на льду в течение 30 минут, смешивая содержимое каждые четыре-пять минут путем инвертирования труб. Центрифуга труб при 20 000 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Тогда соберите супернатант.
Удалите бесплатный биотин, запуская образец через столбец опреснив. Удалите герметику в нижней части колонны и поместите его в 50 миллилитровую трубку. Затем ослабьте крышку и центрифугу колонки в 1000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение двух минут.
Поместите опресняемую колонку в свежую 50-миллилитровую трубку и трижды уравновесите столбец пятью миллилитров буфера лиза RIPA. Центрифуга его на 1000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение двух минут и отказаться от потока через каждый раз. Добавьте 1,5 миллилитров белкового экстракта в верхнюю часть смолы в равноовесной колонке.
А когда экстракт попадает в смолу, добавьте еще 100 микролитров буфера лиза RIPA. Центрифуга колонны на две минуты и оставить опресненные образцы на льду до дальнейшего использования. Для количественной оценки экстрактов белка, измерить OD595 с помощью био-рад спектрофотометр.
Нарисуйте стандартную кривую на основе значения градиентного раствора BSA и рассчитайте концентрацию опресненные образцы белка. Эквилибрировать стрептавидин C1 конъюгированных магнитных бусин с одним миллилитром буфера лиза RIPA в течение одной минуты при комнатной температуре. Используйте магнитную стойку, чтобы поглотить бисер в течение трех минут и аккуратно аспирировать раствор.
Затем повторите мыть еще раз. Передача экстракта белка в уравновешенные магнитные бусы и инкубировать трубку при четырех градусах по Цельсию на ночь на ротаторе, чтобы сродство очистить белки. На следующий день, захватить бисер с магнитной стойкой и аспирировать супернатант.
Затем вымойте шарики с 1,7 миллилитров буфера мыть один, добавив его в трубку и инкубировать его на роторе в течение восьми минут. Удалите супернатант, как описано ранее, и повторите стирку с 1,7 миллилитров буфера мытья два и мыть буфер три. Добавьте 1,7 миллилитров 50 миллимолярной Tris HCL для удаления моющего средства.
Затем поместите трубку на магнитную стойку и удалите супернатант. Повторите стирку с одним миллилитром 50 миллимолейных Tris HCL и перенесите шарики в новую 1,5 миллилитровую трубку. Наконец, мыть бисер шесть раз с 50 миллимолярия аммония бикарбонат буфера в течение пяти минут за стирку.
Используйте 100 микролитров бисера для иммуноблотного анализа, чтобы подтвердить обогащение биотинилированных белков и флэш-заморозку остальной части образца, который будет храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Западные помарки были использованы для анализа экспрессии белка и биотинилирования в агроинфильтрированных листьях N.benthamiana. Биотинилированные белки в инфильтрированных листьях эффективно обогащались стрептавидином C1, конъюгированными магнитными бусинами для последующего анализа масс-спектрометрии.
Различные белки с различными размерами были захвачены и западный анализ пятно обогащенных белков показали смазаны полос. При попытке этой процедуры, пожалуйста, не забудьте удалить уплотнитель в нижней части опреснения столбца и ослабить крышки перед каждой центрифугации. Этот протокол легко адаптируется к другим белкам, представляющим интерес в Nicotiana benthamiana, а также может быть использован для расширения TurboID PL в других видах растений.
