Метилирование ДНК является одним из наиболее изученных эпигенетических подписей. Многие виды рака характеризуются изменениями в уровнях метилирования ДНК, которые связаны с аномальным экспрессией генов и другими геномными аномалиями. Длинные перемежаются ядерные элементы повторяющиеся транспонируемые геномные последовательности, которые обычно имеют высокий уровень метилирования.
Однако они часто становятся гиперметилированными при раке, что приводит к их активации и приводит к хромосомной нестабильности. В этом исследовании, мы лечили мезенхимальных стволовых клеток с остеосаркомы полученных внеклеточных пузырьков, чтобы увидеть, является ли рак EVs может повлиять на LINE-1 метилирования в MECs. Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, которая является неотъемлемым компонентом средств массовой информации культуры клеток млекопитающих, содержит большое количество эв, полученных из крупного рогатого скота.
Эти Evs будет вмешиваться в анализ Evs из клеток, представляющих наш интерес, поэтому, при выращивании клеток для изоляции EV, важно использовать EV-исчерпаны FBS. Возьмите FBS в ультрацентрифуг трубки и поместите их в ультрацентрифуг ведра. Сбалансировать ведра в пределах 10 миллиграммов друг от друга до загрузки их на размахивая ротором.
Поместите ротор в ультрацентрифуг и запустите при 100 000 Г в течение 19 часов при четырех градусах Цельсия. После пробежки тщательно соберите светлый верхний слой супернатанта и перенесите его в 50-миллилитровую трубку. Не беспокоить или трубчатые темно-коричневые гранулы, как он содержит EVs от FBS.
Перейдите супернатант через фильтр 0,22 микрона в новую 50-миллилитровую трубку. Этот фильтр-стерилизованный, EV-обедненный FBS теперь можно добавить к средствам культуры клетки когда растущие клетки для изоляции EV. Сбор условных средств массовой информации из остеосаркомы клеток, выращенных в EV-истощенных средств массовой информации.
Чтобы удалить клетки и клеточный мусор, центрифуга условных средств массовой информации на 2500 G в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите супернатант в ультрацентрифуговые трубки и сбалансируете их, как и раньше. Центрифуга труб при 100 000 Г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.
Тщательно отбросьте супернатант, оставив около одного миллилитра внизу. Добавить около 20 миллилитров PBS в трубку и трубчатые мягко для того, чтобы вымыть и повторно приостановить EV гранулы. Сбалансировать трубки и провести еще один раунд ультрацентрифугации с теми же настройками.
Аккуратно удалите супернатант и повторно приостановите гранулы EV в 200 микролитров PBS нежным пипетки. Храните EVs в низкосвязных трубках. Очищенные EVs характеризуются западным blotting, анализом отслеживания наночастиц, и микроскопией электрона передачи.
Плита 15 000 MSCs на колодец в 24 хорошо пластины. Через 24 часа удалите старые средства массовой информации, вымойте клетки с помощью PBS и перевестите на EV-обедненные средства массовой информации. Лечить ячейки с OS-EVs в запланированные точки времени.
После остановки лечения EV, извлечь ДНК из клеток с помощью соответствующего метода. Для анализа метилирования мы использовали индивидуальный метод усиления метилирования. Дизайн индивидуальных зондов LINE-1, как это было сделано ранее, Pavicic и другие.
Для метилирования зондов выберите три последовательности, содержащие место ограничения HhaI в регионе промоутера. Для контрольных зондов выберите семь последовательностей, не имеющих места ограничения HhaI, из остальной части последовательности LINE-1. Разбавить 70 нанограммов образца ДНК в буфере TE до пяти микролитров.
Нагрейте образцы в течение 10 минут при температуре 98 градусов по Цельсию, затем охладим до 25 градусов по Цельсию. Добавьте три микролитров смеси гибридизации зонда к каждому образцу и запустите термоциклер, чтобы позволить зондам гибридизироваться с ДНК. При комнатной температуре добавьте в каждый образец 30 микролитров постмиоциализации.
Перенесите 10 микролитров на вторую трубку. Поместите оба набора трубок в термоциклер и инкубировать при 48 градусах по Цельсию, по крайней мере одну минуту. В то время как образцы находятся на 48 градусов по Цельсию, добавить 10 микролитров перевязки смеси в первый набор труб и 10 микролитров перевязки пищеварения смесь для второго набора труб.
Запустите следующую программу термоцильцера. Затем скручиваем трубы и одновременно устанавливаем термоциклер до 72 градусов по Цельсию. Добавьте пять микролитров смеси полимеразы в каждую трубку и поместите трубки в термоциклер.
Запустите программу PCR. Пока работает программа PCR, подготовь решение из одного миллилитрового формамида, содержащего 2,5 микролитров стандартного размера. Pipet 10 микролитров этого раствора для каждого ряда оптической пластины 96 хорошо.
После ПЦР разбавляют непереваренные и переваренные образцы до одной-одной сотни и от одной до двухсот, соответственно, в ультра чистой воде. Добавьте два микролитров разбавленного ПЦР-продукта к пластине 96 хорошо. Центрифуга пластины на 200 G в течение 15 до 20 секунд, чтобы удалить пузырьки воздуха.
Проведение фрагментарного анализа образцов капиллярным электрофорезом. Открытие капиллярного электрофореза приводит к программному обеспечению для анализа электроферограммы. Выберите образец и установите панель на MLPA из меню.
Нажмите на панель и нажмите управление D, чтобы применить этот параметр ко всем образцам. Аналогичным образом установите метод анализа на микроспутник по умолчанию для всех образцов. Выберите все образцы и нажмите на зеленую кнопку воспроизведения для запуска анализа, затем выберите все образцы и нажмите на кнопку графика, чтобы визуализировать пики зонда.
Увеличьте масштаб пиковой области для более высокого разрешения отдельных пиков. Убедитесь, что все 10 пиков, соответствующих зондам из смеси зонда LINE-1, помечены. Во вкладке генотипов экспортировать результаты в формате CSV.
Откройте файл CSV в программном обеспечении для анализа данных и сортируете данные в столбцы. Наклеить этикетку на три пика метилирования в зависимости от их размеров. Остальные семь пиков соответствуют контрольных зондам.
Здесь мы используем пики зонда LINE-1 2M размером примерно 117 базовых пар. Для каждого образца вычислите область пиковой суммы всех семи контрольных пиков. Разделите пиковую площадь каждого зонда LINE-1 на эту сумму.
Для каждого образца разделите значение переваренного образца на непереваренный образец для получения соотношения дозы метилирования. Западный анализ blotting подтвердил наличие OS-EVs с сигналами, наблюдаемыми для TSG101, HSP70 и CD63. Отсутствие сигнала кальнексина указывает на чистоту образца EV.
Дополнительное указание на чистоту наблюдалось с TEM с нетронутыми пузырьками различных размеров, присутствующими в образце OS-EV. Концентрация и распределение размеров частиц OS-EV измерялись NTA. 80% EV были в диапазоне размеров от 50 до 200 нанометров.
Здесь мы можем увидеть коэффициенты дозы метилирования LINE-1 от MSCs в разное время точки лечения EV. Серая линия представляет базовый уровень метилирования от нулевой точки времени. В третий момент, есть снижение среднего коэффициента дозы метилирования после введения EVs, тем самым указывая на гиперметилирование.
Этот гиперметилирующий эффект EVs менее выражен в точке времени семь. Здесь мы показали простой, очень чувствительный и надежный метод метилирования анализа. Это требует низкого количества ДНК без бисульфита преобразования участие, а также подходит для ДНК изолированы от парафина встроенных образцов.
Весь метод, с экспериментальными и аналитическими частями, занимает около двух дней. Из-за большого количества копий LINE-1 в геноме, базовое метилирование LINE-1 является высоким в нормальных образцах. Таким образом, различия в уровнях метилирования образцов, как наблюдается с помощью этого метода, могут быть тонкими.
