Многоклеточный комплекс тканей, этот протокол восстанавливает клеточное поведение в упрощенном порядке. Одна вещь этот метод для изучения прямой связи между клеточным проводником протонов и клеточной реакции. Этот протокол использует химически функциональные полистироловые бусы для восстановления протонов клеточного проводника.
Шарики можно вырезать с помощью любых протонов, представляющих интерес, чтобы проверить их влияние на клеточный ответ. Мы использовали этот метод в C-Elegance на эмбрионах мыши. Таким образом, этот протокол может быть вертикально к исследованиям широких организмов.
Поскольку эмбрионы являются хрупкими после высокого полного лечения хлорита, требуется значительная практика, прежде чем можно успешно изолировать бластер. Визуальная демонстрация обеспечит более глубокое понимание того, как следует обрабатывать капилляры во время бластер-изоляции методов. Для начала взвесьте 10 миллиграммов карбоксилата модифицированных полистирола в 1,5-литровой микроцентрифуге трубки.
Добавьте один миллилитров буфера МЕС в трубку для мытья. Vortex трубки, чтобы смешать бисер. Спин трубки в течение 60 секунд на 2000XG через скамейку верхней центрифуги.
Дикард супернатант, тщательно трубопроводов из буфера. Снова вымойте бисер одним миллилитровым буфером МЕ. После мытья добавьте в трубку один миллилитров буфера МЕС, содержащий 10 миллиграммов ЭДАК, чтобы активировать поверхностные карбоксил-группы.
Vortex трубки, чтобы смешать бисер. Поверните и инкубировать трубку в течение 15 минут при комнатной температуре. Спин вниз бисера в течение 60 секунд на 2000XG.
Отбросьте супернатант, тщательно pippetting из буфера, и мыть с одним милли-литровым PBS. Vortex трубки смешать бисер и повторить PBS мыть еще раз. Приготовьте один миллилитров одного, 10, 100 и одну тысячную серию разбавления родамина Red-X из 0,65 миллилитрового раствора Rhodamine Red-X.
Pippette 20 микро-литров бисера в каждой серийной трубки разбавления. Поверните и инкубировать трубки в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте бисер дважды с одним милли-литровым PBS.
После мытья, добавить один милли-литр PBS в трубки и хранить их при четырех градусах по Цельсию на срок до шести недель. Проверьте интенсивность флуоресценции бисера под микроскопом, используемым для живой визуализации. Держите каждый конец микро-капилляра емкостью 10 микролитров правой и левой рукой.
Потяните микро-капилляр к обоим концам, чтобы применить напряжение и принести центр капилляра над горелкой, чтобы сделать два ручных капилляров. Под рассечением микроскопа обрезайте кончики ручных капилляров типсами. Сделайте два кончика открытия размеров примерно в два раза, и один раз короткий доступ длины C-Elegance эмбрионов для переноса эмбриона и удаления яичной скорлупы соответственно.
Прикрепите вытащил капилляр в рот-pippetting аппарата. Pippette 45 микро-литров раствора яичных солей на колодец из нескольких хорошо слайд. Поместите от 5 до 10 взрослых C-Elegance на колодец.
Чтобы получить ранние C-Elegance Embryos разрезать взрослых на куски, позиционирование двух игл справа и слева от тела C-Elegance, и скольжения иглы мимо друг друга. Pippette 45 микро-литров гипохлоритового раствора на колодец рядом с колодцом, содержащим яично-солевой раствор и pippette 45 микро-литров Шелтон в рост среднего на последующие три скважины. Передача одной клеточной стадии и ранних двух клеточных эмбрионов стадии в гипохлоритный раствор рот пиппет с большим размером открытия и ждать от 40 до 55 секунд.
Вымойте эмбрионы, переведя их в следующие три скважины со средним ростом Шелтона. С одной-двух секунд в каждой из первых двух скважин. Используя нарисованный вручную капилляр с меньшим размером открытия тщательно повторить pippetting эмбриона для удаления яичной скорлупы.
После этого, непрерывно pippette с нарисованным вручную капилляром, чтобы отделить двухклеточную стадию эмбриональных бластомер. После удаления яичной скорлупы, свести к минимуму силу в pippetting эмбрионов вверх и вниз, чтобы предотвратить взрыв. Подготовьте камеру визуализации, поместив крышку на держатель крышки и ленты края крышки, чтобы стабилизировать его.
Переверните держатель крышки и нарисуйте круг на крышке гидрофобной ручкой. Добавьте средний рост Шелтона в круг, нарисованный гидрофобным маркером, и перенесите изолированный бластер в камеру визуализации внутри круга. Теперь, обойтись небольшой объем химически функционализированных бусин на крышку с помощью ручной капилляр с большим отверстием.
Контроли положение бисера, дуя в нарисованный вручную капилляр, пока бисер не прикрепится к изолированному бластеру. Намонтировать крышку, чтобы избежать испарения среды и выполнять живые изображения с помощью перевернутого микроскопа. В этом исследовании флуоресцентный сигнал от шарика, обработанного 0,005 микрограммами на миллилитровый родамин Red-X Succinimidyl Ester для трансгенного штамма, выражаюго GFP miosin-2 и M-cherihistone, был слишком слабым.
С другой стороны, флуоресцентный сигнал от бисера, обработанного пятью микрограммами на миллилитровый родамин Red-X Succinimidyl Ester, был слишком сильным. Концентрация родамина Red-X Succinimidyl Ester на уровне 0,5 микрограмма на милли-литр была оптимальной для этого конкретного трансгенного штамма. Во время живого изображения была идентифицирована плоскость, где две центросомы были вертикально выровнены.
Самолет с плюс-минус 90 градусов угол этого самолета шпиндель плоскости. Угол ориентации шпинделя относительно контактного интерфейса клетки/бисера после цитокинесиса показывает, что обе клетки дочери были прикреплены к бисеру в линии, которая проходит оба контактных прицела, была использована в качестве контактной ориентации. Нужно узнать, как эмбрионы и яичная скорлупа реагируют на определенные внешние силы, применяемые рот пиппет.
Теоретически любой клеточный ответ можно изучать, например, спецификацию сульфата можно изучать путем культивирования клеток и контакта с клейкими бусинами в более длительные сроки. Этот метод был использован для понимания механизма ориентации деления клеток, зависящих от контакта. Фильтр PTF был использован для предотвращения вдыхания паров гипохлоритового раствора через рот пиппет.
