Синтетическое летальное взаимодействие между двумя генами происходит, когда один нокдаун любого из них не влияет на жизнеспособность клеток, но нокдаун обоих синтетических смертельных партнеров приводит к потере жизнеспособности клеток или гибели клеток. Объединение гетерогенных наборов данных может привести к выявлению синтетических летальных взаимодействий, которые могут быть нацелены на комбинации лекарств при таких заболеваниях, как рак, с целью остановки пролиферации клеток. Концепция синтетической летальности представляет интерес для любого заболевания, при котором пролиферация клеток является проблемой.
Что касается рака, синтетические смертельные генные взаимодействия уже нацелены на BRCA-мутированные опухоли с использованием ингибиторов PARP. Такие усилия, как наши, могут расширить использование концепции для других генных взаимодействий и раковых образований. В нашей лаборатории мы протестировали вычислительно предсказанные комбинации лекарств, нацеленные на синтетические смертельные взаимодействия в контексте рака молочной железы.
Начните с извлечения данных из BioGRID. Используйте веб-браузер для загрузки последнего файла взаимодействия BioGRID в формате tab2. Отфильтруйте столбцы, чтобы сохранить только те, которые имеют отношение к последующим этапам анализа.
Далее фильтр по синтетической летальности и негативным генетическим взаимодействиям. Используйте информацию в столбце Экспериментальная система, чтобы ограничить набор данных записями со значением отрицательной генетической или синтетической летальности. Определите виды, для которых сообщалось о синтетических смертельных взаимодействиях, путем определения количества налоговых идентификаторов партнеров по синтетическому летальному взаимодействию, что даст оценку количества этих взаимодействий, доступных для каждого организма.
Чтобы получить человеческие ортологи для соответствующих модельных организмов из Ensembl BioMart, выберите соответствующий набор данных модельных организмов, нажмите Атрибуты и выберите Имя гена. Затем нажмите «Набор данных» и выберите «Человеческие гены». Снова нажмите атрибуты и выберите Имя гена.
Затем нажмите Результаты. Проверьте только уникальные результаты и нажмите кнопку Go.Automatize процесс извлечения и отправьте запрос непосредственно в Доступ BioMart RESTful для извлечения ортологичных пар генов. При получении данных вручную через веб-интерфейс Ensembl BioMart переименуйте и обратите внимание, что строка заголовка была добавлена автоматически.
Чтобы получить ортологичные человеческие гены для других модельных организмов, замените значение атрибута name первого элемента набора данных именем соответствующего набора данных Ensembl. Затем отбросьте любые записи для генов без гомологов, соберите все гомологичные карты в одном файле и добавьте фиктивные карты для генов человека. Кроме того, добавьте искусственные записи для генов человека.
Подготовьте файл synlet для последующего объединения, добавив для каждого партнера по взаимодействию новый столбец, вмещая комбинацию идентификатора налогоплательщика и символа гена. Присоединяйтесь к синтетическим летальным взаимодействиям, основанным на идентификаторе налога организма и символе гена, с полученными ортологическими парами. Извлеките пары тарешек лекарств из DrugBank из раздела «Загрузки», создав учетную запись в первую очередь, если это необходимо.
Ограничьте файл drugBank до соответствующих столбцов. Сохраняются записи только для молекулярных объектов человека. Затем извлеките соответствующие столбцы и отфильтруйте данные для человеческих видов.
Поскольку название лекарственного средства и информация о мишени лекарственного средства предоставляются в двух отдельных файлах CSV, информация из двух файлов должна быть объединена. Для этого необходимо сначала нормализовать записи о названии препарата. Затем нормализуйте файл мишени препарата, чтобы он был иметь одну строку на лекарство.
Продолжайте с файлом словаря DrugBank и извлеките соответствующие столбцы. Поскольку название лекарственного средства и информация о мишени лекарственного средства предоставляются в двух отдельных файлах CSV, объедините информацию из двух файлов, используя общий идентификатор DrugBank.Объедините набор данных о синтетическом летальном взаимодействии с файлом названия лекарственного средства-мишени, созданным на предыдущем шаге, используя столбцы символов генов, обязательно добавив названия лекарств для обоих партнеров каждого синтетического летального взаимодействия. Наконец, получите информацию о клинических испытаниях из ClinicalTrials.gov.
Для удобства доступа используйте реляционную базу данных, предоставляемую Инициативой по трансформации клинических испытаний, создав учетную запись в первую очередь, если это необходимо. Растворяют предложенные препараты в соответствующих растворителях, таких как ДМСО или ПБС, по меньшей мере в четырех различных концентрациях. Добавьте препараты к клеткам рака молочной железы человека, посеянным в 96-колоденую пластину, и инкубируем их в течение желаемого количества времени для определения значений ингибирующей концентрации.
Используйте анализ жизнеспособности или апоптоза по выбору для определения жизнеспособности клеток с различными комбинациями и концентрациями лекарств, начиная с ранее установленного IC50. Затем определяют синергетические цитотоксические эффекты комбинаций препаратов путем расчета их комбинаторного индекса. Этот метод использовался для идентификации комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические летальные взаимодействия при раке яичников.
Было обнаружено, что 21 уникальный препарат внес свой вклад в 84 идентифицированные комбинации лекарств, нацеленные на набор из 39 синтетических смертельных интеракторов. Тот же рабочий процесс был использован для идентификации 243 перспективных комбинаций лекарств, нацеленных на 166 синтетических летальных генных пар в контексте рака молочной железы. Отдельные комбинации были протестированы на их влияние на жизнеспособность клеток и апоптоз в двух клеточных линиях рака молочной железы.
Результаты анализа жизнеспособности целекоксиба, золедроновой кислоты и комбинации золедроновой кислоты и целекоксиба в клеточных линиях рака молочной железы SK-BR-3 показали, что при объединении препараты оказали значительное синергетическое влияние на жизнеспособность клеток. Окрашивание аннексином V и 7-AAD клеток SK-BR-3, обработанных двумя препаратами сами по себе и объединенных, показало, что процент поздних апоптотических и некротических клеток был увеличен после лечения комбинацией препарата. При попытке этого протокола потратьте время, необходимое для идентификации соответствующих названий лекарств DrugBank для всех лекарств и вмешательств, полученных в результате клинических испытаний.
Включение дополнительных данных, таких как профили экспрессии генов или степень аннотации, в научную литературу синтетических летальных интеракторов для изучаемого заболевания может быть дополнительно использовано для определения приоритетности синтетических летальных взаимодействий. Из-за растущего количества доступных биомедицинских данных объединение усилий с вычислительными биологами является полезным взаимодействием, ведущим к новым гипотезам, которые будут проверены в лаборатории. При работе с цитостатическими агентами обязательно следуйте местным рекомендациям, касающимся лабораторного оборудования для обеспечения безопасности и обращения с опасными реагентами.
В любой момент времени избегайте прямого контакта и обязательно соберите информацию об используемом веществе до начала эксперимента.
